黃體酮制劑在Beagle犬體內的藥動學研究

李瑞，陳穎，陳迅，張自強

(南京斯泰爾醫藥科技有限公司，江蘇 南京 210046)

黃體酮(progesterone)又名孕酮，是由卵巢黃體分泌的一種天然孕激素，是目前臨床黃體支持的首選藥物[1]。內源性黃體酮可使子宮內膜從增生期轉化為分泌期，從而促使子宮內膜成熟、剝落并維持月經周期。黃體酮制劑在臨床常用的適應證有：黃體功能不全、預防早產、功能失調性子宮出血等。

常用的臨床給藥途徑有口服、注射、陰道給藥3種方式。黃體酮在體內的含量很低(ng級)，故采用傳統的高效液相色譜-紫外(HPLC-UV)法很難準確檢測其體內的血藥濃度，臨床上常用的黃體酮含量測定多采用放射免疫法，但由于交叉免疫[2]反應使得該方法極易受到體內多種結構相似的甾體類激素影響，因此專屬性略顯不足。本文以醋酸甲地孕酮為內標物，血漿經乙腈沉淀處理后進行高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)分析，建立了快速、靈敏、易操作的LC-MS/MS[3-7]方法，并將驗證后的方法應用于比較3種黃體酮制劑經肌內注射給藥后在雄性Beagle犬體內的動力學預實驗研究，可以為黃體酮制劑的后續臨床研究提供借鑒。

1 材料

1.1 藥品與試劑 黃體酮對照品(中國食品藥品檢定研究院，99.7%，批號：100027-201209)；醋酸甲地孕酮(中國食品藥品檢定研究院，99.2%，批號：1000171-201204)；黃體酮-油劑(浙江仙琚制藥股份有限公司，20 mg：1 mL，批號:161102)；參比黃體酮-水劑(Prolutex，Marckyl Pharma，20 mg/0.9 mL，批號：26871)；黃體酮注射液(南京澤恒醫藥技術開發有限公司，20 mg：1 mL，批號：170824)；甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司)；甲酸為色譜級(Sigma Aldrich公司)。

1.2 儀器與設備 高效液相色譜(Agilent 1200)串聯三重四級桿質譜儀(Agilent 6410)，配備ESI離子源，數據處理系統：Mass Hunter Acquisition以及Mass Hunter Qualitative工作站；CPA225D電子天平(Sartorius公司)；超純水機(美國Millipore公司)等。

1.3 實驗動物 雄性Beagle犬6只，體重：7～9 kg，購自北京瑪斯實驗動物有限公司，生產許可證號： SCXK(京)2016-0001；合格證編號：11400600001897，實驗動物使用許可證：SYXK(蘇)2016-0013。

2 方法

2.1 檢測條件 液相色譜條件：Zorbax SB-C8色譜柱(2.1 mm×50 mm，3.5 μm)，流動相：0.1%甲酸∶甲醇(20∶80)，等度洗脫，流速0.4 mL·min-1，柱溫為20 ℃，分析時間為4 min；進樣量：5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI源)；正離子模式檢測；干燥器溫度：450 ℃；流量：12 L·min-1；噴霧壓力：45 Psi；毛細管電壓：3 500 V；檢測方式：多反應離子檢測(MRM)模式進行定量，用于定量分析的離子反應為m/z 315.3→97.1(黃體酮)，碎裂電壓：135 V，碰撞能量：18 V，內標物m/z 385.33→267.2(醋酸甲地孕酮)，碎裂電壓：135 V，碰撞能量：18 V。

2.2 溶液的配制

2.2.1 黃體酮對照品溶液 精密稱取黃體酮對照品適量，加甲醇溶解并定量稀釋制成黃體酮貯備液，濃度為1 mg·mL-1，用前用50%甲醇定量稀釋制成系列濃度的對照品溶液(10、20、50、100、500、1 000、5 000、10 000、20 000 ng·mL-1)，于4 ℃冰箱保存備用。

2.2.2 醋酸甲地孕酮內標溶液 精密稱取醋酸甲地孕酮對照品適量，加乙腈溶解并定量稀釋制成濃度約為50 ng·mL-1的溶液作為內標溶液，于4 ℃冰箱保存備用。

2.3 給藥與血樣采集 6只雄性Beagle犬隨機分為兩組，分別編為A、B兩組，采用單劑量三周期交叉給藥。實驗分為3個階段，第一階段A組給予受試制劑，B組給予參比制劑-油劑；第二階段A組給予參比制劑-油劑，B組給予受試制劑；第三階段A組給予參比制劑-水劑，B組給予參比制劑-水劑。各階段時間間隔為7 d，每一階段給藥劑量均為20 mg的黃體酮制劑。

每次實驗前雄性Beagle犬需禁食12 h(取下喂食的食盒)，自由飲水，第二天肌內注射受試制劑和參比制劑，給藥3 h后正常給水和食物。采血時間分別是給藥前1 h、0.5 h、0 h和給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h，采集靜脈血樣1 mL至加有EDTA-2K+抗凝的采血管，于冰上暫存至離心，全血經8 000 r·min-1離心5 min后收集血漿，轉移血漿至96孔板中，于-20 ℃保存待測。

2.4 血漿樣品處理 取血漿50 μL，加入含有內標的200 μL乙腈沉淀后振蕩5 min，4 000 r·min-1離心(4 ℃)10 min，取150 μL上清液轉移至已加入50 μL純水的干凈96孔板中，渦旋混勻后放入自動進樣器，進樣(5 μL)進行分析。

2.5 統計學處理 采用軟件Phoenix WinNonlin 8.0的非房室模型分析方法對測得的雄性Beagle犬給予3種黃體酮制劑后的血藥濃度數據進行藥動學參數的計算，計算3種黃體酮制劑的主要藥動學參數，并進行描述性統計分析。描述性統計量包括平均值和標準差，通過Tmax、Cmax和AUCINF_obs評價受試制劑與兩種參比黃體酮制劑的差異。

3 結果

3.1 方法學驗證

3.1.1 專屬性試驗 取空白血漿、空白血漿加對照品以及Beagle犬給藥后血漿樣本，按“2.4”項下加內標處理后，進行HPLC-MS/MS分析，黃體酮保留時間為2.1 min，醋酸甲地孕酮保留時間為1.9 min。血漿中的內源性成分不干擾黃體酮和內標的測定，峰形和分離度均良好(見圖1)。

3.1.2 標準曲線與定量下限試驗 取空白雄性Beagle犬血漿450 μL，分別加入不同濃度的黃體酮對照品溶液50 μL，制備系列濃度血漿樣品，即1、2、5、10、50、100、500、1 000、2 000 ng·mL-1的標準血漿，平行兩份。按“2.4”項下方法處理，進樣分析。測得黃體酮峰面積(A)及甲地孕酮峰面積(B)。以黃體酮峰面積對甲地孕酮峰面積平均值的比值(A/B)對黃體酮的血藥濃度(X)作回歸方程計算，測得回歸方程：Y=0.000 535 9X-0.000 023 58(r=0.996 1)，線性范圍為1～2 000 ng·mL-1，定量下限為1 ng·mL-1(S/N>10)。

圖1 血漿中典型黃體酮以及內標的典型MRM色譜圖

3.1.3 殘留效應試驗 在分析標準曲線最高濃度2 000 ng·mL-1血漿樣品后，進樣空白溶劑以考察殘留效應，在待測物的出峰位置未出現明顯干擾峰，表明高濃度樣品不會影響隨后的低濃度樣品測定。

3.1.4 提取回收率與準確度試驗 取空白血漿450 μL，精密加入不同濃度的黃體酮標準溶液50 μL，制備低、中、高(2、100、1 600 ng·mL-1)的血漿，每種濃度各做5份樣品。按“2.4”項下方法處理，進樣分析，記錄峰面積，黃體酮A1和甲地孕酮B1；另配相應濃度的對照品進樣得峰面積A2和B2，提取回收率(%)=A1/A2×100%；將A1/B1帶入標準曲線計算血藥濃度，按照準確度(%)=測得量/添加量×100%，結果見表1。

表1 血漿中黃體酮提取回收率和準確度

結果表明，提取回收率和準確度RSD均≤15%，符合生物樣本測試的要求。

3.1.5 精密度試驗 制備低、中、高3個濃度的血漿質控樣品(2、100、1 600 ng·mL-1)各5份，在日內和日間(連續測定3 d)進行測定，記錄峰面積，代入當天隨行標準曲線，計算黃體酮的濃度，評估日內和日間精密度，結果表明，日內和日間精密度RSD均≤15%，符合生物樣本測試的要求。

3.1.6 基質效應 分別取6只Beagle犬的空白血漿，按“2.4”項下方法處理，制備不加對照和內標的上清液，然后以此上清液制備相應濃度的低、中、高濃度血漿樣品，進樣分析，記錄峰面積(A)，同時用流動相配制低、中、高3個濃度的樣品(加內標)，得峰面積(B)，基質效應=A/B×100%。黃體酮低、中、高3個質控濃度的血漿樣品基質效應分別為94.21%±5.30%、101.24%±3.55%、96.12%±4.64%，內標的基質效應為93.74%±3.67%。結果表明，本實驗條件下黃體酮的測定不受基質效應的干擾。

3.1.7 樣品穩定性試驗 取空白血漿450 μL，精密加入黃體酮對照品溶液50 μL，制備濃度為50 ng·mL-1的質控血漿樣本進行穩定性試驗，反復凍、融3次后處理并測定，RSD為5.32%，-20 ℃凍存，分別于0、1、5、10、15 d測定，RSD為4.77%；室溫放置8 h，分別于0、2、4、8 h測定，RSD為4.09%，自動進樣器放置12 h，分別于0、2、4、8、12 h測定，RSD為2.96%。血漿樣品在各條件下均穩定。

3.2 藥物動力學參數計算 分別給出6只雄性Beagle犬血漿藥物濃度-時間數據及曲線和每組平均值、標準差及曲線，比較受試和參比制劑的主要藥動學差異。

采用軟件Phoenix WinNonlin 8.0的非房室模型計算犬給藥后的藥代動力學參數。達峰濃度Cmax：采用實測值；達峰時間Tmax：采用實測值；藥時曲線下面積AUC0～t值：采用梯形法計算；AUC0～∞=AUC0～t+Ct/ke，Ct為最后一個可測得時間點的血藥濃度，ke為消除速率常數；AUMC：藥物與時間乘積對時間t的積分；平均滯留時間MRT=AUMC/AUC。

給藥前藥物濃度如果能夠檢出，則將給藥前三個時間點藥物濃度取平均值，采用給藥后實測藥物濃度減去給藥前藥物濃度平均值的方法得到給藥后的藥物濃度，然后進行統計。

3.3 結果分析 采用Phoenix WinNonlin 8.0軟件，按統計矩理論分別求算犬給予3種黃體酮制劑后各只犬的相關藥動學參數，詳見表2。

經獨立樣本T檢驗統計分析，受試制劑與參比黃體酮-油劑的AUCINF_obs無統計學差異(P>0.05)，但與參比黃體酮水劑有統計學差異(P<0.05)。受試制劑與參比黃體酮油劑的Cmax有統計學差異(P<0.05)，與參比黃體酮-水劑無統計學差異(P>0.05)。

4 討論

本文建立了LC-MS/MS法檢測了犬血漿中黃體酮的血藥濃度，本法耗時短、準確度好、靈敏度高；并能有效地應用于對3種黃體酮制劑的藥動學考察。實驗結果表明，該方法在黃體酮血漿濃度為1～2 000 ng·mL-1范圍內線性關系良好(r=0.996 1)。日內和日間精密度試驗的RSD均小于15%，方法回收率為85%～115%，定量下限為1 ng·mL-1。本方法穩定，符合生物樣品方法驗證要求[7]。

表2 雄性Beagle犬肌內注射給予3種黃體酮制劑后血漿中黃體酮的藥動學參數(n=6)

注意：*表示2A3犬給藥二次，該動物未用于計算平均藥動學參數；3A2犬的T1/2確定為異常值，可能由于測樣的操作失誤導致

通過雄性Beagle犬三周期分別單次肌內注射給予20 mg/只受試黃體酮注射液、參比黃體酮-油劑、參比黃體酮-水劑后血藥動力學監測結果可知，犬體內黃體酮的達峰時間Tmax分別為(0.19±0.09)h、(1.50±1.40)h和(0.14±0.09)h；Cmax分別為(721.64±238.71)、(104.14±56.70)和(607.83±121.96)ng·mL-1；3種制劑的AUCINF_obs分別為(629.34±169.90)、(796.16±226.16)和(766.27±147.09)h·ng·mL-1。經統計學分析，受試制劑與參比黃體酮-油劑的AUCINF_obs無統計學差異(P>0.05)，但與參比黃體酮水劑有統計學差異(P<0.05)。受試制劑與參比黃體酮油劑的Cmax有統計學差異(P<0.05)，與參比黃體酮-水劑無統計學差異(P>0.05)，本預實驗研究結果為后續黃體酮注射液的臨床應用動力學研究提供了參考。