circ_ZNF609/miR-423-5p軸對高糖誘導腎小管上皮細胞HK2凋亡和氧化應激的機制研究

盧迪 黎瑤 梅希 邱平

糖尿病腎病是糖尿病的常見并發癥，也是引起終末端腎功能衰竭的主要原因[1]。糖尿病患者長期處于高血糖狀態，腎小管上皮細胞經高糖刺激后可產生過度的氧化應激和炎性反應，進一步引起腎小管上皮細胞凋亡或壞死，這也是糖尿病腎病發生的重要原因[2]，因此，抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞氧化應激和凋亡對糖尿病腎病的治療尤為重要。circ_ZNF609是一種環狀RNA(circRNA)，參與多種疾病的發生發展。研究顯示，circ_ZNF609在膠質瘤、宮頸癌、前列腺癌和胃癌等腫瘤中表達上調，作為促癌基因促進腫瘤發展進程[3-6]。circ_ZNF609可通過靶向miR-22-3p/ENO1軸促進慢性縮窄性損傷(CCI)大鼠炎性因子表達，加重神經型疼痛進展[7]；circ_ZNF609在視網膜神經變性過程中表達上調，沉默其表達可減少視網膜反應性神經膠質增生和神經膠質細胞活化，其有可能成為視網膜神經變性治療的分子靶點[8]。但是，circ_ZNF609能否影響腎小管上皮細胞氧化應激和凋亡還未知。circRNA可靶向結合微小RNA(miRNA)分子海綿作用調控miRNA靶基因的表達，進而發揮生物學調控作用[9]。Starbase靶基因在線軟件預測顯示，circ_ZNF609可能靶向結合miR-423-5p。研究顯示，miR-423-5p在糖尿病腎病患者腎組織中表達下調，上調miR-423-5p可靶向抑制Nox4減少高糖誘導的足細胞凋亡，并抑制足細胞氧化應激和炎性損傷，miR-423-5p可作為糖尿病腎病治療的分子靶標[10]。本研究以腎小管上皮細胞HK2為研究對象，主要觀察了circ_ZNF609對高糖誘導的HK2細胞凋亡和氧化應激的影響及其能否靶向miR-423-5p發揮作用，以期為糖尿病腎病的治療提供分子靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 HK2細胞系，上海通派生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技有限公司；RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物；低糖DMEM培養液、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶；circ_ZNF609小干擾RNA(si-circ_ZNF609)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-423-5p抑制劑(inhibor)、miR-423-5p 模擬物(mimc)、模擬對照序列(miR-NC)及PCR引物，上海生工；LipofectamineTM 2000試劑盒，美國Invitrogen公司；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒，南京建成；兔抗人Cleaved-caspase3和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體，中國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：從液氮罐中取出HK2細胞，在超凈工作臺內復蘇。加含10% FBS的低糖DMEM培養液，置于37℃、CO2體積分數5%、濕度97%的培養箱中培養。當細胞密度生長至90%時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養。

1.2.2 RT-qPCR檢測circ_ZNF609和miR-423-5p表達：取6孔板中，接種HK2細胞(5.0×105個/孔)。培養12 h后，棄培養液，分組處理。分為對照(NC)組和高糖(HG)組，其中HG組細胞用含25 mmol/L[11]葡萄糖培養液培養，NC組細胞用含等滲透壓25 mmol/L甘露醇的培養液培養。培養24 h后，收集細胞。用RNA抽提試劑盒提取細胞中總RNA，經逆轉錄后，行PCR擴增。引物序列：circ_ZNF609上游5’-CAGCGCTCAATCCTTTGGGA-3’，下游5’-GACCTGCCACATTGGTCAGTA-3’；miR-423-5p上游5’-GTACGACAGCTCGCGTAGC-3’，下游5’-CGTCGCGCTAGGCGA-3’；GAPDH上游5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游5’-AGTCCTTCCA CGATACCA AAGT-3’；U6上游5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，下游5’-CCAGTGCAGGGTCCG AGGT-3’。2-△△Ct法計算circ_ZNF609 相對GAPDH、miR-423-5p相對U6的表達量。

1.2.3 細胞轉染：取6孔板中，接種HK2細胞(5.0×105個/孔)。培養12 h后，棄培養液，換為不含FBS的培養液。用LipofectamineTM 2000脂質體法，分別轉染si-NC、si-circ_ZNF609、miR-NC、miR-423-5p mimics、共轉染si-circ_ZNF609與miR-423-5p inhibor。轉染12 h后，更換為常規培養液，再培養24 h，RT-qPCR法檢測細胞中circ_ZNF609或miR-423-5p表達驗證轉染效果，并收集細胞用于后續實驗。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖活性：取96孔板中，接種HK2細胞或轉染后的HK2細胞(2.5×104個/孔)，培養12 h后，棄培養液，分組處理。HK2細胞分為NC組和HG組，處理同上述1.2.2。轉染si-NC、si-circ_ZNF609、miR-NC、miR-423-5p mimics、共轉染si-circ_ZNF609與miR-423-5p inhibor的HK2細胞均用含25 mmol/L葡萄糖的培養液培養，并分別記為HG+si-NC、HG+si-circ_ZNF609、HG+miR-NC、HG+miR-423-5p mimic、HG+si-circ_ZNF609+miR-423-5p inhibor。培養24 h后，每孔加10 μl CCK-8試劑。孵育2 h后，酶標儀(450 nm)檢測各孔光密度(OD)值。以NC組細胞存活率為100%。細胞存活率(%)=OD實驗組/ODNC組×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡：取6孔板中，接種HK2細胞或轉染后的HK2細胞(1.0×105個/孔)，培養12 h后，棄培養液，分組處理，同上述1.2.4。培養24 h后，收集各組細胞。用磷酸鹽緩沖液清洗2次，加500 μl結合緩沖液，重懸細胞。利用10 μl Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測各組細胞凋亡。凋亡率(%)=(早期凋亡數+晚期凋亡數)/總細胞數×100%。

1.2.6 蛋白印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達：細胞接種和分組處理同上述1.2.5，培養24 h后，用RIPA試劑提取各組細胞中總蛋白。用二喹啉甲酸法檢測蛋白含量，行10% SDS-PAGE電泳，并將分離蛋白轉至PVDF膜，于5%脫脂奶粉中封閉2 h。然后于4℃冰箱中分別用Cleaved-caspase3(1∶500)、GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液孵育12 h，洗膜后，再于7℃搖床中用山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育1 h。加化學發光試劑，避光顯影，曝光拍照，Image J 軟件分析Cleaved-caspase3相對GAPDH的表達量。

1.2.7 試劑盒檢測細胞中SOD活性和MDA含量：細胞接種和分組處理同上述1.2.5，培養24 h后，棄培養液。加細胞裂解液充分裂解細胞，收集裂解液離心(3 500 r/min、5 min)，取上清液，分別按照SOD和MDA試劑盒說明書，檢測上清中SOD活性和MDA含量。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因實驗：利用PCR技術擴增含miR-423-5p結合位點的circ_ZNF609核苷酸序列，插入pGL3載體，構建circ_ZNF609野生型熒光素酶載體(WT-circ_ZNF609)。利用基因突變技術將結合位點突變，插入pGL3載體，構建circ_ZNF609突變型熒光素酶載體(MUT-circ_ZNF609)，該過程由上海生工生物工程股份有限公司完成。取6孔板中，接種HK2細胞(5.0×105個/孔)。培養12 h后，棄培養液，換為不含FBS的培養液。用LipofectamineTM2000脂質體法，分別共轉染WT-circ_ZNF609與miR-NC或miR-423-5p mimic、MUT-circ_ZNF609與miR-NC或miR-423-5p mimic。轉染12 h后，更換為常規培養液，再培養24 h，棄培養液，充分裂解細胞。將細胞裂解液離心(3 500 r/min、5 min)，取上清液，檢測細胞熒光素酶活性，結果以螢火蟲與海腎的熒光強度的比值表示。

2 結果

2.1 高糖對HK2細胞中circ_ZNF609和miR-423-5p表達的影響 與NG組比較，HG組HK2細胞中circ_ZNF609表達量增加(P<0.05)，miR-423-5p表達量減少(P<0.05)。見表1。

表1 高糖對HK2細胞中circ_ZNF609和miR-423-5p表達的影響

2.2 下調circ_ZNF609對高糖誘導的HK2細胞活性和凋亡的影響 轉染si-circ_ZNF609的HK2細胞中circ_ZNF609表達量明顯低于轉染si-NC的細胞(0.19±0.07比 1.00±0.00，t=20.042，P<0.05)，說明下調circ_ZNF609的HK2細胞構建成功。與NG組比較，HG組HK2細胞增殖活性降低(P<0.05)，細胞凋亡率和細胞中凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3的表達升高(P<0.05)。與HG組或HG+si-NC組比較，HG+si-circ_ZNF609組HK2細胞增殖活性升高(P<0.05)，細胞凋亡率和細胞中凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3的表達降低(P<0.05)。HG組與HG+si-NC組各檢測指標比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖1，表2。

圖1 下調circ_ZNF609對HK2細胞凋亡的影響；A 下調circ_ZNF609抑制高糖誘導的HK2細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達；B 下調circ_ZNF609抑制高糖誘導的HK2細胞凋亡

表2 下調circ_ZNF609對高糖誘導的HK2細胞凋亡的影響

2.3 下調circ_ZNF609對高糖誘導HK2細胞氧化應激的影響 與NG組比較，HG組HK2細胞中SOD活性降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)。與HG組或HG+si-NC組比較，HG+si-circ_ZNF609組HK2細胞中SOD活性升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)。HG組與HG+si-NC組各檢測指標比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 下調circ_ZNF609對高糖誘導HK2細胞氧化應激的檢測

2.4 circ_ZNF609靶向結合miR-423-5p Starbase靶基因在線軟件預測顯示circ_ZNF609與miR-423-5p的結合位點。與共轉染 WT-circ_ZNF609與miR-NC的HK2細胞比較，共轉染WT-circ_ZNF609與miR-423-5p的HK2細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與共轉染MUT-circ_ZNF609與miR-NC的HK2細胞比較，共轉染MUT-circ_ZNF609與miR-423-5p的HK2細胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。同時，轉染si-circ_ZNF609的HK2細胞中miR-423-5p表達量明顯高于轉染si-NC的細胞(2.81±0.27比1.00±0.00，t=11.611，P<0.05)，說明下調circ_ZNF609促進HK2細胞中miR-423-5p的表達。見表4，圖2。

表4 雙熒光素酶報告活性檢測

圖2 circ_ZNF609和miR-423-5p的互補序列

2.5 上調miR-423-5p對高糖誘導的HK2細胞凋亡和氧化應激的影響 轉染miR-423-5p mimic的HK2細胞中miR-423-5p表達量明顯高于轉染miR-NC的細胞(2.59±0.24比1.00±0.00，t=11.475，P<0.05)，說明上調miR-423-5p的HK2細胞構建成功。與HG+miR-NC組比較，HG+miR-423-5p mimic組HK2細胞增殖活性升高(P<0.05)，細胞凋亡率和細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達降低(P<0.05)，細胞中SOD活性升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 上調miR-423-5p對高糖誘導的HK2細胞凋亡及氧化應激的影響

圖3 上調miR-423-5p對HK2細胞凋亡及Cleaved-caspase3蛋白表達的影響；A 上調miR-423-5p抑制高糖誘導的HK2細胞凋亡；B 上調miR-423-5p抑制高糖誘導的HK2細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達

2.6 下調miR-423-5p逆轉下調circ_ZNF609對高糖誘導HK2細胞凋亡和氧化應激的影響 共轉染si-circ_ZNF609與miR-423-5p inhibor的HK2細胞中miR-423-5p 表達量明顯低于轉染si-circ_ZNF609的細胞，差異有統計學意義(1.16±0.09比2.79±0.25，t=10.625，P<0.05)，說明HK2細胞miR-423-5p下調構建成功。與HG組比較，HG+si-circ-ZNF609組細胞和SOD活性升高(P<0.05)。凋亡率、Cleaved-caspase3、MDA降低(P<0.05)，與HG+si-circ_ZNF609組比較，HG+si-circ_ZNF609+miR-423-5p inhibor組HK2細胞增殖活性降低(P<0.05)，細胞凋亡率和細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)，細胞中SOD活性降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)。見表6,圖4。

表6 下調miR-423-5p逆轉下調circ_ZNF609對高糖誘導HK2細胞凋亡及氧化應激的影響

圖4 下調miR-423-5p逆轉下調circ_ZNF609對高糖誘導HK2細胞凋亡和Cleaved-caspase3蛋白表達的影響；A 下調miR-423-5p可減弱下調circ_ZNF609對高糖誘導HK2凋亡的抑制作用；B 下調miR-423-5p可減弱下調circ_ZNF609對高糖誘導HK2細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達的抑制作用

3 討論

腎小管上皮細胞損傷是糖尿病腎病發生發展的主要原因，探究影響腎小管上皮細胞損傷的分子機制可為其治療提供分子靶點。高糖是引起腎小管上皮細胞損傷的主要誘因，其可引起腎小管上皮細胞過度氧化應激，進一步誘導細胞凋亡[12]。本研究結果顯示，腎小管上皮細胞HK2經高糖處理后，細胞凋亡加劇，細胞中氧化應激指標MDA含量增加，而SOD活性降低，與Wang等[13]報道結果一致，說明高糖誘導腎小管上皮細胞HK2產生了氧化應激和凋亡。

circRNA是一類結構呈閉合環狀的非編碼RNA，性質穩定，在真核生物中廣泛存在。作為一種circRNA，目前circ_ZNF609對腎小管上皮細胞損傷的影響還未知。本研究結果顯示，高糖可促進腎小管上皮細胞HK2中circ_ZNF609的表達，提示circ_ZNF609可能促進高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷；通過下調腎小管上皮細胞HK2中circ_ZNF609的表達發現，下調circ_ZNF609可降低高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3的表達，說明下調circ_ZNF609可減少高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡，減輕了細胞損傷，其可能成為糖尿病腎病治療的分子靶點。腎小管上皮細胞損傷與炎性反應和氧化應激等密切相關。高糖刺激下，腎小管上皮細胞分泌并釋放大量炎性因子，這些炎性因子進一步刺激腎小管上皮細胞產生過度氧化應激反應，引起細胞內脂質過氧化，生成大量MDA[14]。SOD是細胞內重要的抗氧化應酶，其可清除氧自由基減輕氧化應激反應[15]。本研究結果顯示，下調circ_ZNF609可明顯降低高糖誘導的腎小管上皮細胞中MDA含量，并提高SOD活性，說明下調circ_ZNF609可能通過降低細胞內氧化應激水平減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷。

circRNA可發揮miRNA分子海綿作用，調控miRNA靶基因的表達，進而影響細胞凋亡和氧化應激等生理或病理過程[16]。為了進一步探究下調circ_ZNF609抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和氧化應激的分子機制，本研究證實了circ_ZNF609可靶向結合并負調控miR-423-5p，這與本文HK2細胞經高糖處理后circ_ZNF609表達上調而miR-423-5p表達下調的結果一致。miR-423-5p屬于miRNA家族成員，參與調控細胞凋亡、氧化應激及炎性反應，在多種疾病中發揮調控作用。研究顯示，芹菜素可能通過上調miR-423-5p并抑制USF2的表達減輕鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病腎病大鼠腎組織炎癥和腎纖維化[17]；上調miR-423-5p可減輕LPS誘導的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)大鼠肺損傷、炎癥和纖維化[18]；過表達miR-423-5p可通過下調KCTD20減輕MPP誘導的神經細胞SK-N-SH損傷[19]。本研究結果顯示，上調miR-423-5p可減少高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡，并抑制細胞氧化應激水平，提示miR-423-5p也可作為減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的分子靶點。此外，本研究結果表明，下調miR-423-5p逆轉了下調circ_ZNF609對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和氧化應激的抑制作用，進一步提示下調circ_ZNF609通過靶向上調miR-423-5p來阻礙高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和氧化應激。

綜上，高糖促進腎小管上皮細胞中circ_ZNF609的表達，而抑制miR-423-5p表達；下調circ_ZNF609可有效阻礙高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和氧化應激，其作用機制可能與其靶向結合并上調miR-423-5p表達有關，circ_ZNF609/miR-423-5p軸可能為糖尿病腎病的治療提供了潛在分子靶點，但尚需進一步在體內進行驗證，且miR-423-5p下游靶基因和信號通路對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的影響也還有待進一步探究。