類葉升麻苷調控miR-496表達對高糖誘導小鼠腎臟足細胞損傷的影響

王麗 盧發菊 李薇 馬明福

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最為嚴重的微血管并發癥之一，是終末期腎臟疾病的主要原因。近年來，DN發病率急劇上升，已成為嚴重的全球公共衛生問題[1]。最近研究表明，在高血糖刺激下足細胞損傷并導致腎小球濾過率下降和持續性蛋白尿，是DN早期發生的關鍵因素[2]。因此，減輕高糖誘導的足細胞損傷可能對DN防治具有重要價值。類葉升麻苷又叫麥角甾苷，是一種重要的、在多種植物中分布的天然產物，具有抗炎、抗氧化、神經保護、抗腫瘤等生物活性。研究顯示，類葉升麻苷對PC12細胞缺糖缺氧損傷具有保護作用[3]。此外，類葉升麻苷可以通過調節TH22淋巴細胞的趨化性和增殖來減輕系膜細胞炎性損傷，改善尿蛋白排泄[4]。然而，筆者發現類葉升麻苷對高糖誘導的足細胞損傷是否具有保護作用鮮有報道。近年來，微小RNA(miRNA)作為天然的存在的非編碼調節分子受到越來越多的關注，且多種miRNA通過調節足細胞的丟失和功能障礙在DN進展中發揮作用[5,6]。現有研究顯示，miR-496在2型糖尿病患者外周血單核細胞中表達下調，過表達miR-496可減輕缺氧復氧誘導的心肌細胞損傷[7,8]。本研究通過觀察類葉升麻苷對高糖誘導的足細胞損傷以及miR-496表達的影響，探討其潛在分子機制，以期為類葉升麻苷用于防治DN提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠腎臟足細胞(MPC5)購自上海通派生物科技公司；γ干擾素購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清購自美國Invitrogen公司；類葉升麻苷(純度≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；miR-496模擬物(miR-496 mimics)、模擬物陰性對照(miR-NC)、miR-496抑制物(anti-miR-496)、抑制物陰性對照購(anti-miR-NC)自上海吉凱基因化學技術有限公司；膜聯蛋白V異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購于上海凱基生物；兔源腎病蛋白(nephrin)單克隆抗體、兔源足突蛋白(podocin)單克隆抗體、兔源Bcl-2單克隆抗體、兔源Bax單克隆抗體、兔源GAPDH多克隆抗體以及山羊抗兔IgG二抗購于美國Abcam公司；miRNA逆轉錄試劑盒、SYBR Green Mix購于北京天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:參照黎妮等[9]方法采用RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清和γ干擾素)于33℃、含5%CO2的培養箱中培養MPC5細胞。細胞80%融合時進行傳代，更換為含5%胎牛血清、不含γ干擾素的培養基于37℃、含5%CO2的培養箱培養14 d使其分化成熟。實驗前用不含γ干擾素的培養基同步化培養24 h后備用。

1.2.2 實驗分組:取生長狀態良好的MPC5細胞接種6孔板，按照實驗分組進行如下處理。①正常糖(NG)組：補充5 mmol/L葡萄糖；高糖(HG)組：補充30 mmol/L葡萄糖；高糖+類葉升麻苷-低劑量(HG+AS-L)組：補充30 mmol/L葡萄糖和1.0 μmol/L類葉升麻苷；高糖+類葉升麻苷-中劑量(HG+AS-M)組：補充30 mmol/L葡萄糖和10.0 μmol/L類葉升麻苷；高糖+類葉升麻苷-高劑量(HG+AS-H)組：補充30 mmol/L葡萄糖和100.0 μmol/L類葉升麻苷。各組孵育48 h后，分別檢測細胞凋亡、nephrin和podocin蛋白表達以及miR-496表達情況。②為證實類葉升麻苷對高糖誘導的足細胞損傷的保護作用與調控miR-496表達有關，將MPC5細胞分為HG+miR-NC組、HG+miR-496組、HG+AS+anti-miR-NC組、HG+AS+ anti-miR-496組。HG+miR-NC組、HG+miR-496組為利用LipofectamineTM 2000將miR-NC、miR-496分別轉染60%融合的MPC5細胞，轉染48 h后，用補充30 mmol/L葡萄糖的培養液孵育細胞48 h。HG+AS+anti-miR-NC組、HG+AS+anti-miR-496組為將anti-miR-NC、anti-miR-496分別轉染MPC5細胞，轉染48 h后，用補充30 mmol/L葡萄糖和100.0 μmol/L類葉升麻苷的培養液孵育細胞48 h。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡:用胰蛋白酶處理各組貼壁細胞獲得單細胞懸液。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌并離心去除上清液后，加入195 μl結合溶液輕柔重懸細胞。然后，加入5 μl的Annexin V-FITC輕輕混勻，然后加入10 μl的PI染色液。在20℃下暗室中孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 蛋白質印記(Western blot)檢測nephrin、podocin、Bcl-2和Bax蛋白表達:加入細胞裂解液冰上裂解細胞，獲得細胞總蛋白，定量后煮沸3 min使其變性。取30 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，隨后利用濕法轉膜儀將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜。在封閉和洗滌后，將膜與一抗溶液(nephrin為1∶5 000，podocin、Bcl-2和Bax為1∶2 000)在37℃下孵育45 min。充分洗滌后，膜與二抗在37℃孵育45 min。再次洗膜后，用增強化學發光顯色液暗室顯影。凝膠成像系統分析各條帶灰度值，以目的蛋白和內參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.2.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-496表達:Trizol試劑提取各組細胞的總RNA。提取后，利用miRNA逆轉錄試劑盒將miRNA樣品逆轉錄為cDNA。使用SYBR Green Mix通過RT-qPCR擴增cDNA模板。U6作為miR-496的內部對照，2-ΔΔCt法分析miR-496相對表達量。miR-496上游引物5’-GCCGAGTGAGTATT ACATGGCC-3’，miR-496下游引物5’-TGAGTATTACATGGCCAATCTC-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2 結果

2.1 類葉升麻苷對高糖誘導的小鼠足細胞中nephrin和podocin蛋白表達的影響 與NG組比較，HG組MPC5細胞中nephrin和podocin蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H組MPC5細胞中nephrin和podocin蛋白表達顯著升高(P<0.05)，且HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H3組間nephrin和podocin蛋白表達比較有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 nephrin和podocin蛋白表達

表1 類葉升麻苷對高糖誘導的小鼠足細胞中nephrin和podocin蛋白表達的影響

2.2 類葉升麻苷對高糖誘導的小鼠足細胞凋亡的影響 與NG組比較，HG組MPC5細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H組MPC5細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著升高，且HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H3組間上述指標比較均有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 類葉升麻苷高糖誘導的小鼠足細胞凋亡的影響；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表2 類葉升麻苷對高糖誘導的小鼠足細胞凋亡的影響

2.3 類葉升麻苷對高糖誘導的小鼠足細胞中miR-496表達的影響 與NG組比較，HG組MPC5細胞miR-496表達顯著降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H組MPC5細胞miR-496表達顯著升高(P<0.05)，且HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H3組間miR-496表達比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 類葉升麻苷對高糖誘導的小鼠足細胞中miR-496表達的影響

2.4 上調miR-496對高糖誘導的小鼠足細胞中nephrin和podocin蛋白表達的影響 與HG+miR-NC組比較，HG+miR-496組MPC5細胞miR-496表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，nephrin和podocin蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 上調miR-496對高糖誘導的小鼠足細胞中nephrin和podocin蛋白表達的影響

圖3 nephrin和podocin蛋白表達

2.5 上調miR-496對高糖誘導小鼠足細胞凋亡的影響 與HG+miR-NC組比較，HG+miR-496組MPC5細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 上調miR-496對高糖誘導的小鼠足細胞凋亡的影響；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表5 上調miR-496對高糖誘導的小鼠足細胞凋亡的影響

2.6 下調miR-496表達逆轉了100 μmol/L類葉升麻苷高糖誘導小鼠足細胞損傷作用 與HG+AS+anti-miR-NC組比較，HG+AS+anti-miR-496組MPC5細胞miR-496表達顯著降低，nephrin、podocin和Bcl-2蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率和Bax蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 下調miR-496逆轉了類葉升麻苷高糖誘導的小鼠足細胞損傷的作用；A nephrin、podocin和凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表6 下調miR-496逆轉了類葉升麻苷高糖誘導的小鼠足細胞損傷的作用

3 討論

已有的研究顯示，類葉升麻苷主要存在于地黃屬、肉蓯蓉屬和連翹屬等植物中，除具有抗衰老、免疫增強、保肝、增強記憶力等作用外，在慢性腎炎、IgA腎病等泌尿系統疾病中具有保護作用[10,11]。然而，類葉升麻苷對高糖誘導的足細胞損傷是否具有保護作用仍有待證實。

nephrin和podocin是足細胞狹縫隔膜上的主要結構成分，其緊密作用于足突的外膜，調節足細胞與基底膜之間的關系，在維持腎濾過屏障的完整性中起著重要作用[12]。上調podocin和nephrin蛋白可減少DN大鼠尿蛋白排泄率，緩解DN進展[13]。本研究發現高糖誘導后MPC5細胞nephrin和podocin蛋白表達顯著降低，而類葉升麻苷處理呈劑量依賴效應提高高糖誘導的MPC5細胞中nephrin和podocin蛋白表達水平。與本研究結論類似，丁方睿等[14]證實類葉升麻苷通過恢復足細胞標記物nephrin表達，保護足細胞骨架，進而緩解嘌呤霉素誘導的足細胞損傷。細胞凋亡是DN早期足細胞病理性丟失的重要原因。Bax和Bcl-2是參與細胞凋亡的兩個關鍵蛋白，其在包括在足細胞內多種細胞凋亡中發揮重要作用[15]。本研究顯示高糖誘導后MPC5細胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax表達顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著降低，而類葉升麻苷處理呈劑量依賴效應減輕高糖對MPC5的促凋亡作用。以上研究說明，類葉升麻苷處理對高糖誘導的足細胞損傷具有保護作用。

近年來，越來越多研究證實miRNA在調節足細胞的生理和病理發生中的潛在作用。Wu等[16]指出在嘌呤霉素氨基核苷處理的大鼠中，miR-30的缺失可誘導蛋白尿和足細胞損傷。Zhang等[17]發現下調miR-770-5p表達可抑制高糖誘導的足細胞凋亡和炎性反應。本研究發現高糖誘導的MPC5細胞中miR-496表達下調，通過轉染外源性miR-496 mimics上調miR-496表達能夠減輕高糖誘導的MPC5細胞凋亡，并提高nephrin和podocin蛋白的表達水平，提示上調miR-496表達對高糖誘導的MPC5細胞損傷具有保護作用。與本研究結論類似，Yao等[18]證實上調miR-496還可降低腦缺血/再灌注損傷。類葉升麻苷處理后，高糖誘導的MPC5細胞中miR-496的表達水平呈劑量依賴性顯著升高，提示類葉升麻苷對高糖誘導的MPC5細胞的保護作用可能與上調miR-496表達有關。進一步研究發現，下調miR-496表達能夠逆轉類葉升麻苷對高糖對誘導的MPC5細胞凋亡、nephrin和podocin蛋白、凋亡相關蛋白表達的影響，這進一步說明類葉升麻苷通過上調miR-496表達對高糖對誘導的MPC5細胞損傷具有保護作用。

總之，本研究證實類葉升麻苷對高糖誘導的小鼠足細胞損傷具有保護作用，其機制與上調miR-496表達有關，這為類葉升麻苷用于防治DN奠定了實驗基礎。