沉默lncRNA DNAH8-AS1靶向miR-186-5p/YY1調控前列腺癌細胞的增殖和侵襲

程漢波，劉加元，賈 波，張 鵬，鄧思文，姚俊波，高瑞輝

前列腺癌是嚴重威脅男性生殖健康的惡性腫瘤，其發病率和病死率呈逐年上升趨勢[1]。前列腺癌的臨床治療主要包括手術、化療和激素等治療，由于前列腺癌的早期臨床診斷較困難，且發現多已為中晚期，患者的預后較差[2-3]。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA)是在人體細胞內高度保守的非編碼RNA，可能在前列腺癌的發生、發展中發揮癌基因或抑癌基因的功能[4-5]。lncRNA在前列腺癌組織中異常表達，下調或上調其表達可顯著影響前列腺癌細胞的生長和侵襲[6-7]。lncRNA DNAH8-AS1由830個核苷酸連接構成，其在細胞中的功能尚未見報道。miR-186-5p在前列腺癌、膀胱癌、胃癌等組織中呈低表達，可顯著抑制腫瘤細胞的增殖、化療抵抗、侵襲等行為[8-10]。本文探討lncRNA DNAH8-AS1在前列腺癌中的表達，分析其對前列腺癌細胞生物學行為的影響及對miR-186-5p的靶向調控作用，為前列腺癌的診療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料前列腺癌細胞系PC-3、LNCaP、DU-145、C4-2B與正常前列腺上皮細胞RWPE-1組均購自中科院上海生科院細胞庫。lncRNA DNAH8-AS1 siRNA(si-DNAH8-AS1組)、陰性對照siRNA(Control組)、miR-186-5p mimic、NC mimic、熒光素酶報告載體(Wt-DNAH8-AS1、Mut-DNAH8-AS1、Wt-YY1、Mut-YY1)，均購自上海吉瑪制藥公司。qRT-PCR試劑盒和TRIzol試劑盒，均購自美國Sigma公司。RPMI 1640培養基、胎牛血清、KSFM培養基，均購自美國Hyclone公司。MTT試劑盒購自上海生工生物公司；生物素標記的雜交探針購自廣州銳博生物公司。轉染試劑Lipofectamine 3000和Matrigel基質膠，均購自美國Invitrogen公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和Transwell小室購自美國Promega公司。一抗MARK4、YAP、TAZ、α-Tubulin、YY1均購自美國BD公司。

1.2 細胞培養及轉染用含10%胎牛血清的KSFM培養基培養RWPE-1細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養PC-3、LNCaP、DU-145、C4-2B，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。轉染前收集LNCaP細胞接種于12孔板，待細胞融合至60%，以無血清RPMI 1640培養基稀釋si-DNAH8-AS1、Control組為100 nmol/L，以Lipofectamine 3000脂質體進行轉染，分別為si-DNAH8-AS1組和Control組。收集各組對數生長期LNCaP細胞進行后續研究。

1.3 生物信息學技術分析lncRNA DNAH8-AS1表達及靶向基因采用GEPIA數據庫分析lncRNA DNAH8-AS1在前列腺癌和癌旁組織中的表達及與前列腺癌臨床分期的關系；采用LncBase Predicted v.2軟件預測lncRNA DNAH8-AS1存在結合位點的miRNA。

1.4 原位雜交實驗檢測lncRNA DNAH8-AS1在前列腺癌和癌旁組織中表達采用石蠟包埋組織，連續3 μm厚切片，脫蠟。采用4%過氧化氫對內源性過氧化物酶進行滅活，經2%多聚甲醛溶液在室溫下固定20 min。加入30 μL生物素標記的雜交探針，42 ℃孵育過夜。滴加辣根過氧化氫酶標記的鏈霉親和素，在37 ℃濕盒中孵育4 h。滴加DAB試劑進行DAB顯色，采用蘇木精試劑進行復染，乙醇脫水后采用中性樹脂封固。

1.5 qRT-PCR檢測細胞中miR-186-5p、DNAH8-AS1和YY1 mRNA的表達TRIzol試劑盒提取前列腺癌細胞、正常前列腺上皮細胞和轉染后LNCaP細胞總RNA，通過超微量分光光度計測定RNA濃度，通過反轉錄試劑盒合成cDNA。配制PCR反應體系，以GAPDH為內參檢測lncRNA DNAH8-AS1和YY1 mRNA的表達，以U6為內參檢測miR-186-5p的表達。lncRNA DNAH8-AS1上游引物：5′-ACACCAACAGACACCAGCAG-3′，下游引物：5′-GGTTCAGCACTGTGGGTTTT-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；YY1上游引物：5′-ACGGCTTCGAGGATCAGATTC-3′，下游引物：5′-TGACCAGCGTTTGTTCAATGT-3′；miR-186-5p上游引物：5′-GCGGCGGCAAAGAATTCTCC-3′，下游引物：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。采用2-ΔΔCt方法計算miR-186-5p、DNAH8-AS1和YY1 mRNA相對表達。

1.6 MTT法檢測敲減DNAH8-AS1對LNCaP細胞增殖的影響收集Control組和si-DNAH8-AS1組對數生長期LNCaP細胞，以每孔150 μL接種于96孔板。實驗分別在培養1、2、3、4、5天棄去培養基，加入15 μL質量濃度為5 g/L的MTT溶液，充分混勻，避光培養3.5 h，棄去上清；每孔加入130 μL的二甲基亞砜，充分混勻。通過酶標儀上檢測各孔在波長450 nm處的光密度值，代表LNCaP細胞增殖水平。

1.7 Transwell實驗檢測敲減DNAH8-AS1對LNCaP細胞侵襲的影響通過RPMI 1640培養基稀釋Matrigel膠，在Transwell上室加入200 μL稀釋后的Matrigel膠。收集Control組和si-DNAH8-AS1組對數生長期LNCaP細胞，制備無血清單細胞懸液，分別加入200 μL細胞懸液至Transwell上室，在下室加入500 μL含胎牛血清的RPMI 1640。恒溫培養箱培養24 h后，棉簽除去未穿過Matrigel膠的細胞，經5%多聚甲醛固定，0.3%結晶紫染液染色。洗去多余染液，晾干后于100倍顯微鏡下拍照，選取6個視野計數穿膠細胞數。

1.8 熒光素酶報告基因實驗檢測lncRNA DNAH8-AS1與miR-186-5p/YY1的靶向關系采用Lipofectamine 3000脂質體分別將Wt-DNAH8-AS1、Mut-DNAH8-AS1與miR-186-5p mimic、NC mimic共轉染到LNCaP細胞；采用Lipofectamine 3000脂質體分別將Wt-YY1、Mut-YY1與miR-186-5p mimic、NC mimic共轉染到LNCaP細胞。檢測NC組和miR-186-5p組LNCaP細胞中的相對熒光素酶活性，具體操作按雙熒光素酶報告基因實驗試劑盒說明書進行。

1.9 Western blot實驗檢測YY1蛋白和Hippo信號通路相關蛋白的表達收集Control組和si-DNAH8-AS1組對數生長期LNCaP細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，通過SDS-PAGE膠電泳目的蛋白，以半干膜轉膜法轉移至硝酸纖維素膜，加入10%脫脂牛奶封閉。加入一抗YY1(1 ∶2 000)、MARK4(1 ∶2 000)、YAP(1 ∶1 000)、TAZ(1 ∶1 000)、α-Tubulin(1 ∶3 000)，置于冰箱內保存。加入二抗(1 ∶10 000)，在室溫下保存3 h。加入ECL顯影液，在凝膠成像分析系統中曝光，通過Quantity One軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2 結果

2.1 前列腺癌組織中lncRNA DNAH8-AS1的表達GEPIA數據庫顯示，與癌旁組織相比，lncRNA DNAH8-AS1在前列腺癌組織中呈高表達(P<0.01，圖1)；lncRNA DNAH8-AS1表達水平與前列腺癌臨床分期呈正相關(P<0.05，圖2)。原位雜交檢測顯示，前列腺癌組織中lncRNA DNAH8-AS1的表達明顯高于癌旁組織(圖3)。

圖1 GEPIA數據庫顯示lncRNA DNAH8-AS1在前列腺癌和癌旁組織中的表達

圖2 GEPIA數據庫顯示前列腺癌中lncRNA DNAH8-AS1表達與臨床分期的關系

2.2 lncRNA DNAH8-AS1在前列腺癌細胞系中的表達qRT-PCR檢測結果顯示，與正常前列腺上皮細胞RWPE-1相比，lncRNA DNAH8-AS1在前列腺癌細胞PC-3、LNCaP、DU-145、C4-2B中呈高表達(P<0.05)；其中lncRNA DNAH8-AS1在LNCaP細胞中的表達水平最高(P<0.01，圖4)。因此，用LNCaP細胞進行進一步研究。

AB

圖4 前列腺癌和正常前列腺上皮細胞中lncRNA DNAH8-AS1的表達

2.3 si-DNAH8-AS1敲減LNCaP細胞中lncRNA DNAH8-AS1的表達qRT-PCR檢測結果顯示，Control組和si-DNAH8-AS1組LNCaP細胞中lncRNA DNAH8-AS1表達分別為6.44±0.56和1.08±0.37。與Control組比較，si-DNAH8-AS1組LNCaP細胞中lncRNA DNAH8-AS1表達水平顯著降低(P<0.01)。

2.4 敲減lncRNA DNAH8-AS1表達與LNCaP細胞增殖的關系MTT法檢測結果顯示，與Control組相比，si-DNAH8-AS1組LNCaP細胞在轉染后第2、3、4、5天時增殖活力均顯著降低(P<0.05，圖5)，表明敲減lncRNA DNAH8-AS1可抑制LNCaP細胞的增殖。

2.5 敲減lncRNA DNAH8-AS1表達與LNCaP細胞侵襲的關系Transwell實驗結果顯示，Control組和si-DNAH8-AS1組LNCaP細胞穿過Matrigel基質膠的細胞數分別是(63.39 ± 8.03)個和(23.94 ± 3.86)個。與Control組比較，si-DNAH8-AS1組侵襲細胞數明顯減少(P<0.01，圖6)，表明敲減lncRNA DNAH8-AS1可抑制LNCaP細胞的侵襲。

圖5 敲減lncRNA DNAH8-AS1對LNCaP細胞增殖的影響

圖6 敲減lncRNA DNAH8-AS1對LNCaP細胞侵襲的影響：A.Transwell檢測侵襲細胞數；B.侵襲細胞數直方圖

2.6 lncRNA DNAH8-AS1靶向結合miR-186-5p/YY1用生物信息學軟件LncBase Predicted v.2軟件預測顯示：lncRNA DNAH8-AS1與miR-186-5p存在結合位點，miR-186-5p與YY1 mRNA存在結合位點(圖7)。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示：與NC組相比，miR-186-5p mimic顯著抑制Wt-DNAH8-AS1的熒光素酶活性(P<0.01)，對Mut-DNAH8-AS1熒光素酶活性無明顯抑制作用(P>0.05，圖8A)。與NC組相比，miR-186-5p mimic顯著抑制Wt-YY1的熒光素酶活性(P<0.01)，對Mut-YY1熒光素酶活性無明顯抑制作用(P>0.05，圖8B)。

圖7 lncRNA DNAH8-AS1、YY1 mRNA的結合位點：均含有與miR-186-5p互補的核苷酸序列

圖8 雙熒光素酶報告基因實驗：A.lncRNA DNAH8-AS1可互補結合miR-186-5p;B.YY1 mRNA可互補結合miR-186-5p

2.7 敲減lncRNA DNAH8-AS1對LNCaP細胞中miR-186-5p和YY1 mRNA表達的影響qRT-PCR檢測結果顯示，Control組和si-DNAH8-AS1組LNCaP細胞中miR-186-5p的表達分別為1.02±0.22和5.62±0.98，si-DNAH8-AS1組明顯高于Control組(P<0.01)；Control組和si-DNAH8-AS1組LNCaP細胞中YY1 mRNA的表達分別為5.24±1.21和1.09±0.27，si-DNAH8-AS1組明顯低于Control組(P<0.01)。

2.8 miR-186-5p對LNCaP細胞中YY1 mRNA表達的影響qRT-PCR檢測結果顯示，NC組和miR-186-5p組LNCaP細胞中miR-186-5p的表達分別為1.04±0.37和8.91±1.27，miR-186-5p組明顯高于NC組(P<0.01)。NC組和miR-186-5p組LNCaP細胞中YY1 mRNA的表達分別為7.82±1.38和1.07±0.36，miR-186-5p組明顯低于NC組(P<0.01)。

2.9 敲減lncRNA DNAH8-AS1對YY1蛋白和Hippo信號通路相關蛋白表達的影響Western blot檢測結果顯示，敲減lncRNA DNAH8-AS1后，YY1蛋白表達下調，MARK4、YAP、TAZ等Hippo信號通路相關蛋白表達下調(圖9)。

圖9 敲減lncRNA DNAH8-AS1對LNCaP細胞中YY1和Hippo信號通路相關蛋白表達的影響

3 討論

大量lncRNA芯片研究顯示，lncRNA是前列腺癌早期診斷、預后評估的獨立分子標志物，廣泛參與組織細胞的再生和惡性轉化[11-12]。lncRNA表達失調影響前列腺癌的血管生成、激素抵抗、化療耐藥等生物學過程[13]。Cui等[14]研究表明，lncRNA AC245100.4在前列腺癌中表達上調，其主要定位于細胞質中，敲低lncRNA AC245100.4有效抑制前列腺癌細胞的增殖。Li等[15]研究表明，lncRNA BLACAT1在前列腺癌組織樣本和細胞系中表達下調，與其啟動子的甲基化程度相關，lncRNA BLACAT1可通過靶向吸附并降低miR-361的表達，抑制前列腺癌細胞的增殖。lncRNA可能作為前列腺癌的分子標志物和治療靶點，具有廣泛的臨床應用價值[16]。

lncRNA DNAH8-AS1在前列腺癌中的表達及對前列腺癌發生的調節機制并未闡明。本實驗發現lncRNA DNAH8-AS1在前列腺癌組織和細胞中均呈高表達，lncRNA DNAH8-AS1表達水平越高，患者的臨床分期越差，提示lncRNA DNAH8-AS1高表達可能與前列腺癌癌變過程有關。本組進一步研究顯示，敲降lncRNA DNAH8-AS1表達后，LNCaP細胞的增殖和侵襲能力均明顯下降，證實lncRNA DNAH8-AS1在前列腺癌發生過程中起癌基因的作用。

lncRNA能夠與miRNA互補配對結合，通過抑制miRNA表達，正向調控miRNA靶基因的表達，影響細胞的生命活動[17-18]。本組通過生物信息學網站預測lncRNA DNAH8-AS1可能競爭性吸附miR-186-5p，雙熒光素酶報告基因實驗驗證兩者的靶向結合。Liu等[19]研究表明，miR-186-5p在順鉑抗性的非小細胞肺癌組織和細胞(A549和H1299)中表達下調，miR-186-5p過表達可以抑制A549和H1299細胞的增殖、遷移和侵襲，促進凋亡率。Jin等[8]研究表明，miR-186-5p在前列腺癌組織和細胞中低表達，上調miR-186-5p能夠抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。進一步研究顯示，抑制lncRNA DNAH8-AS1表達后，可逆轉miR-186-5p在前列腺癌細胞中的低表達；提示敲減lncRNA DNAH8-AS1可通過促進miR-186-5p表達，抑制前列腺癌LNCaP的細胞增殖和侵襲。本實驗通過生物信息學網站預測miR-186-5p可能競爭性吸附YY1 mRNA，雙熒光素酶報告基因實驗驗證兩者的靶向結合。本組miR-186-5p表達上調后，YY1基因表達顯著降低，進一步證實miR-186-5p靶向抑制YY1基因表達。YY1蛋白是一種包含鋅指結構的內源性轉錄因子，影響細胞的分化、增殖、轉移等行為[20]。近年研究顯示，YY1蛋白在前列腺癌等腫瘤中高表達，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，發揮癌基因的功能[21]。文獻報道YY1蛋白通過激活Hippo信號通路，促進腫瘤細胞的惡性生物學過程[22]。本組YY1蛋白表達下調后，MARK4、YAP、TAZ等Hippo信號通路相關蛋白表達下調，表明Hippo信號通路活化程度降低。

綜上所述，lncRNA DNAH8-AS1在前列腺癌中呈高表達，與臨床分期呈正相關。敲減lncRNA DNAH8-AS1通過靶向調控miR-186-5p/YY1基因表達，影響Hippo信號通路活化，抑制前列腺癌LNCaP細胞的增殖和侵襲。因此，lncRNA DNAH8-AS1有望成為前列腺癌潛在的早期診斷標志物和治療靶點。