組織離體時間對乳腺癌ER、PR、HER-2、Ki-67染色表達的影響

范柳倩，孟潔瓊，程國平

浸潤型原發性乳腺癌中ER、PR、Ki-67增殖指數和HER-2，是最顯著的預后相關預測因素。同時，能有效指導治療[1]。ER陽性患者可從內分泌治療中受益，PR也具有類似的指導作用。有研究報道15%～20%乳腺癌中HER-2過表達，其表達與較高的復發率和病死率相關。Ki-67增殖指數是乳腺組織中腫瘤細胞的主要參考檢查之一。組織樣本處置是分析前階段的關鍵影響變量，根據美國臨床腫瘤學協會(ASCO)及美國病理醫師學院(CAP)的相關指南進行操作[2]。目前，臨床相關指南建議乳腺癌切除樣本應盡可能在短時間內固定，離體時間應低于1 h，但離體時間過長對ER、PR、HER-2等免疫組化染色結果的影響相關報道仍較少。本科室經過多年摸索，總結了組織離體時間對乳腺癌免疫組化染色重要標志物的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年6月～2021年10月來我院就診且接受手術的8例乳腺癌組織。納入標準：(1)明確診斷乳腺癌且接受手術切除治療；(2)術中可獲得足夠組織樣本用于實驗分析。排除標準：(1)患者接受新輔助化療；(2)有既往乳腺手術史；(3)免疫組化染色失敗。

1.2 組織樣本處理每例標本根據不同離體時間(0、0.5、1、2、4、24、48 h)及室溫下和4 ℃冰箱保存，分為14個組織，合計112個標本。標本均經10%中性福爾馬林固定8～48 h，按常規行組織處理，包埋，3 μm厚連續切片。行HE染色，采用免疫組化檢測ER、PR、HER-2和Ki-67的表達。載玻片上未染色的組織切片于干燥箱內加熱1 h，干燥溫度為60 ℃。ER評估采用單克隆抗體SP1(Ventana, Tucson, AZ)；使用單克隆抗體1E2(Ventana)評估PR；4B5抗體(Ventana)對HER-2進行分析，Ki-67采用MIB-1單克隆抗體進行檢測。本實驗均使用Ventana BenchMark XT在自動模式對切片進行染色，染色結果均由同一位臨床經驗豐富的病理醫師進行評分。

1.3 結果判斷激素受體通過ASCO/CAP標準進行定性評分[3]，即對ER和PR腫瘤細胞≥1%為陽性；兩者定量評分采用H評分法。將陽性細胞染色百分比與染色強度兩者相乘，其中無著色為0分，弱著色為1分，中等著色為2分，強著色為3分；總分為0～300，0表示腫瘤中無染色，300分表示腫瘤組織呈彌漫強染色。HER-2評分分為陰性(0、1+)、不確定(2+)、陽性(3+)。Ki-67評分為免疫染色細胞核數量占總腫瘤細胞核數量的百分比，計數在切片的3個隨機選擇區域內進行(400×)，評分范圍0～100%。文獻報道其表達值分為：低(<15%)、中(16%～30%)和高(>30%)三類。本實驗將HER-2與Ki-67的三個等級結果亦表示為強度等級以便于統計分析，相同抗體染色的0 h(對照)由同一位病理醫師重新進行回顧和評分，沖洗時間間隔為數小時，若隨著時間間隔延長染色減少始終存在，則確認存在染色減少；若僅在特定時間段內出現局灶性的減少，則認為是由于腫瘤樣本的異質性造成。

2 結果

2.1 室溫環境下不同離體時間對免疫組化染色的影響術中切除的組織樣本均分為室溫下及4 ℃冰箱冷藏保存。室溫下不同標志物隨不同離體時間延長相應H評分的變化：0 h樣本中HER-2、ER、PR、Ki-67的H評分的平均值與中位數分別為180(150)、210(102)、132(105)、106(100)，各個標志物H評分均呈逐漸降低趨勢，4、24、48 h與0 h相比差異均有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.2 4 ℃環境下不同離體時間對免疫組化染色的影響不同標志物隨離體時間延長亦出現染色逐漸減少的趨勢變化。

表1 常溫條件下不同標志物隨組織離體時間延長H評分變化[平均值(中位數)]

雖然冷藏樣本中平均H評分與0 h相比差異無顯著性，但自4 h起平均H評分逐漸降低。與室溫下的染色變化對比，離體時間自2、4、24、48 h差異有顯著性(P均<0.05)，即4 ℃冷藏環境中的染色強度表達降低幅度更低(表2)。

2.3 染色變化定性分析定性分析用于查看是否有樣本自陽性轉為陰性。本組各個標志物在室溫和冷藏下不同離體時間相應染色強度等級的陽性率變化統計，各標志物中室溫下逐漸降低的趨勢明顯高于冷藏條件。冷藏樣本與室溫下轉為陰性的組織樣本分別為4、7例，但差異無顯著性(P=0.341，圖1)。

圖1 各標志物染色表達的定性分析：A.HER-2在不同離體時間、不同保存條件染色強度的對比；B.ER在不同離體時間、不同保存條件染色強度的對比；C.PR在不同離體時間、不同保存條件染色強度的對比；D.Ki-67(MIB-1)在不同離體時間、不同保存條件染色強度的對比

表2 4 ℃環境下不同標志物隨組織離體時間延長H評分變化[平均值(中位數)]

3 討論

激素受體的表達是乳腺癌中最重要的生物學標志物，且是最佳個體治療決策的基石。病理診斷術中切除的組織由于血流中斷不穩定、大分子的活性逐漸喪失，導致組織缺血、缺氧、酸中毒和酶降解，該過程受離體時間長短的影響[4-5]。雖然組織缺血、缺氧、酸中毒和酶降解無法控制，但可通過適當的標本處理來控制組織離體時間。標準離體時間即組織切除至福爾馬林固定組織滲透的時間，是確定ER、PR等標志物表達的重要步驟[6-7]。本實驗旨在探討不同離體時間對浸潤型乳腺癌樣本生物學標志物表達水平檢測結果的影響，實驗發現室溫條件下不同標志物隨離體時間延長亦出現染色逐漸減少的變化；而各標志物在冷藏條件下，不同離體時間相應染色強度等級的陽性率降低的趨勢明顯低于室溫條件。由此可見，不同離體時間、不同的儲存條件對于組織染色強度的影響較大。

目前，由福爾馬林固定延遲引起的長時間腫瘤缺血可導致標志物表達降低。有學者將改良根治性乳腺切除組織樣本中ER、PR蛋白水平，與核心針活檢結果進行比較，結果顯示核心針活檢標本中腫瘤激素受體蛋白表達實驗有缺陷，作者認為組織樣本的延遲固定可能是最主要的原因。本組以組織離體時間0 h作為對照組，更具有研究價值和代表性。因此，對于激素治療的患者，妥善的組織樣本管理至關重要[8]。文獻報道福爾馬林固定前，于室溫下將標本分別保持不同時間段，發現ER表達在2 h后下降，離體時間1 h后PR表達開始下降，離體時間8 h后ER不表達；4 ℃下過夜處理亦出現類似結果。因此，建議組織樣本獲得后盡可能1 h內進行固定[9]。本實驗亦顯示隨著組織離體時間的延長，激素受體的表達水平普遍降低，提高激素受體和HER-2檢測的準確性，改善其作為乳腺癌標志物預測患者臨床預后的效能還具有挑戰性，但隨著離體時間的延長，乳腺癌相關標志物的有效檢測率均出現明顯降低。因此，應將組織離體時間最小化，以做到對組織樣本的妥善評價[10-11]。組織染色中環境、溫度亦起到顯著影響，室溫與冰箱冷藏溫度相比，對乳腺癌的預測因子病理檢查影響更為顯著[12-13]，與本組結果基本一致。

綜上所述，與冰箱內4 ℃固定標本相比，室溫下標本受組織離體時間(≤2 h)的影響更大。臨床實踐中需遵循ASCO/CAP指南<1 h的建議，將組織離體時間盡可能縮短。