PARP9促進肺腺癌細胞的遷移和侵襲

鄭 芬 周曉敏 吳家雪

（復旦大學生命科學學院遺傳學系 上海 200438）

肺癌的發生率和死亡率居高不下，全世界每年約有180萬例肺癌病例。肺癌具有異質性，分為多種亞型，肺腺癌是最常見的亞型。由于肺癌被診斷時多已處于晚期且伴隨轉移，預后相對較差，探究肺癌發病與轉移的分子機制意義重大［1-2］。ADP-核糖基化是一種由細胞內聚（ADP-核糖）聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］催化的翻譯后修飾 反 應，PARP家族中已鑒定出17個成員［3］。PARP家族成員及其介導的ADP-核糖基化反應在細胞生命進程中發揮重要作用，包括DNA修復、細胞黏附、脂質代謝、細胞增殖或死亡等［4-5］。

PARP家族成員9（PARP9），又被稱為B侵襲性淋巴瘤蛋白（B-aggressive lymphoma-1 protein，BAL1），最初作為彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLB-CL）的風險基因被報道，PARP9過表達會促進惡性B細胞遷移［6］。PARP9的N末 端 為 兩 個Macro結 構 域，C末端為PARP催化結構域，因缺乏對自身的催化活性，早期認為PARP9是無活性的單-ADP-核糖基轉移酶［7］。然而，Yang等［8］指出PARP9/DTX3L異二聚體介導對泛素的單-ADP-核糖基化。研究表明，PARP9主要在DNA損傷修復和病毒感染過程中發揮作用［9-10］。多項研究揭示PARP9在腫瘤中表達上調，如彌漫性大B淋巴瘤、前列腺癌和乳腺癌等，并在腫瘤發展中發揮重要作用［6，11-12］，但其在肺腺癌中的作用尚未見報道。

本研究首先對PARP9在肺腺癌中的表達和預后意義進行分析，并通過實驗探究其對肺腺癌細胞H1299與A549遷移和侵襲能力的影響，以增強對于PARP9在肺腺癌中的作用認識，同時為探尋肺腺癌的診療靶點提供新思路。

材料和方法

數據集和數據庫采用常見腫瘤數據庫進行基因表達分析。癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）計劃收錄了多種癌癥的臨床信息和基因組數據，臨床蛋白質組學腫瘤分析聯盟（clinical proteomic tumor analysis consortium，CPTAC）整合了腫瘤基因組和蛋白質組的數據。通 過UALCAN［13］（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）對TCGA和CPTAC數據進行挖掘和分析，在UALCAN中進行基因表達分析和生存分析。基因表達數據庫（Gene Express Omnibus，GEO）由美國國立生物技術信息中心創建，儲存高通量測序數據。我們使用GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）的肺腺癌數據集GSE31210進行基因表達分析。

免疫組化分析75例肺腺癌組織及配對正常組織樣本由上海芯超生物科技有限公司提供（編號：HLugA150CS03），3例因脫片無法統計，且存在少量臨床數據缺失。使用PARP9抗體（17535-1-AP，美國Proteintech公司）進行免疫組化染色（1∶1 000），根據免疫染色強度分級（0：無染色；1：弱染色；2：中等染色；3：強染色），同時按照免疫染色百分比分級（0級：0；0＜1級≤25%；25%＜2級≤50%；51%＜3級≤75%；75%＜4級≤100%）。免疫染色強度評分與免疫染色百分比評分的乘積為PARP9染色總分，然后將樣本分為PARP9表達陰性（總分≤3）和PARP9表達陽性（總分＞3）。

細胞系和細胞培養人肺腺癌細胞A549和H1299來自中國科學院上海細胞庫。細胞在含有10%胎牛血清（德國PAN公司）和1%青霉素和鏈霉素（上海翊圣生物科技有限公司）的RPMI 1640培養基（美國Gibco公司）中培養，培養條件為37℃、5% CO2、潮濕培養。

PARP9缺陷和PARP9回補細胞系的構建使用CRISPR/Cas9敲除PARP9，將靶向PARP9的兩條sgRNA連接至質粒載體（sgRNA1：5'-GAGATAGCTGTCACGGGAGCAGG-3'和sgRNA2：5'-TTATCCCATTCCATCCACCGAGG-3'），然 后 轉 染A549和H1299細胞，梯度分盤后使用嘌呤霉素篩選3天，正常培養，直至長出肉眼可見的克隆。對單克隆基因組測序，并進行Western blot檢測，篩選成功敲除的細胞。使用慢病毒感染來恢復PARP9表達缺陷細胞中的PARP9。將慢病毒包裝系統的3個質粒（PCDH、PxpaX2、PMD2g）轉染到HEK293T細胞中進行病毒包裝，用含有病毒的上清液感染敲除細胞。流式分選后，通過Western blot鑒定陽性感染的細胞。

Western blot檢測使用SDS-PAGE分離蛋白，用半干轉膜儀將蛋白質轉移到經甲醇激活的PVDF膜上，將PVDF膜與5%的脫脂牛奶一起孵育，封閉30 min后洗膜，然后與含Flag（M20008）、βactin（P30002）和PARP9（17535-AP）的一抗，在4℃下孵育過夜，洗膜后將PVDF膜與偶聯辣根過氧化物酶的二抗在室溫下孵育30 min。使用ECL系統記錄結果。

細胞遷移和侵襲檢測使用無血清培養基重懸細胞，計數后加入Transwell小室的內室，將小室置于24孔板中，外室加入完全培養基，培養36 h。室溫下用4%多聚甲醛固定細胞，并用0.2%結晶紫染色，用棉簽輕輕擦去內室的細胞，對外室遷移的細胞進行拍照計數。進行侵襲實驗時，提前在Transwell小室的內室加入用無血清培養基稀釋的Matrigel，后續操作同遷移實驗。

統計學分析使用GraphPad Prism 5.0對實驗結果進行繪圖和統計分析；使用Image J對細胞進行計數；使用獨立樣本t檢驗比較兩組數據，以±s顯示結果；使用Log-rank檢驗進行PARP9高表達和低表達患者的生存差異分析；使用χ2檢驗進行PARP9表達與患者臨床病理信息的相關性分析。實驗重復3次，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

PARP9在肺腺癌患者中高表達且預后不良我們首先通過分析TCGA數據庫中的mRNA數據來評估PARP9在肺腺癌中的表達水平。結果顯示，PARP9在肺腺癌組織中的表達水平顯著高于鄰近正常組織（P＜0.001，圖1A）。同時，來自GEO數據庫的數據進一步證實了這一結果（P=0.002，圖1B）。接下來，我們分析了CPTAC數據庫中PARP9的蛋白水平。與mRNA結果一致，肺腺癌組織中PARP9的蛋白水平也顯著高于正常組織（P＜0.001，圖1C）。使用PARP9的抗體對72例肺腺癌樣本及其配對正常組織進行免疫組化染色，進一步評估了PARP9的表達，結果同樣顯示，與正常組織相比，PARP9在肺腺癌中顯著高表達（t=8.909，P＜0.001，圖1D）。結合免疫組化染色結果，我們對PARP9的表達與肺腺癌患者臨床病理信息之間的相關性進行了分析，結果表明PARP9的表達水平與肺腺癌患者的臨床分期（χ2=4.309，P=0.038）和淋巴結轉移（χ2=3.916，P=0.048）具有相關性，而與性別、年齡、腫瘤大小無相關性（表1）。此外，TCGA數據庫的Kaplan-Meier生存分析表明，PARP9高表達的肺腺癌患者總生存期顯著短于PARP9低 表 達 的 患 者（P=0.041，圖1E），提 示PARP9的表達與肺腺癌患者的不良預后正相關。

圖1 PARP9在肺腺癌及正常組織中的表達與預后Fig 1 Expression and prognosis of PARP9 in lung adenocarcinoma and normal tissues

PARP9缺陷顯著抑制肺腺癌細胞的遷移與侵襲我們設計了兩條靶向PARP9第3號外顯子的向導RNA，在H1299與A549細胞中敲除PARP9，對獲得的細胞單克隆提取基因組在敲除位點進行DNA擴增與Sanger測序，選擇基因組含有非3整數倍堿基缺失的單克隆，使用PARP9抗體進行Western blot驗證，結果顯示敲除組內PARP9蛋白的表達丟失（圖2A、2B），表明PARP9缺陷細胞株構建成功。由于PARP9的表達水平與肺腺癌患者淋巴結轉移顯著相關（表1），使用Transwell小室對PARP9在肺腺癌細胞遷移中的功能進行測定。與野生型細胞相比，PARP9缺陷型H1299細胞與A549細胞的遷移能力均顯著降低（H1299組：KO1，t=4.206，P=0.003；KO2，t=15.81，P＜0.001；A549組：KO1，t=9.310，P＜0.001；KO2，t=7.795，P＜0.001）（圖2C），提示PARP9缺陷抑制肺腺癌細胞的遷移。腫瘤細胞侵襲能力同樣是影響腫瘤轉移的重要因素，在Transwell小室的內室添加基質膠預處理，進行侵襲實驗。與野生型細胞相比，PARP9缺陷的H1299細胞和A549細胞的侵襲能力顯著降低（H1299組：KO1，t=18.460，P＜0.001；KO2，t=12.730，P＜0.001；A549組：KO1，t=3.754，P=0.006；KO2，t=4.573，P=0.002）（圖2D），表明PARP9缺陷抑制肺腺癌細胞的侵襲。

圖2 PARP9缺陷對肺腺癌細胞的遷移和侵襲能力的影響Fig 2 Effects of PARP9 deficiency on the migration and invision of lung adenocarcinoma cells

表1 肺腺癌組織中PARP9表達與患者臨床資料的相關性分析Tab 1 Correlation analysis between PARP9 expression in lung adenocarcinoma tissues and clinical data of the patients

PARP9恢復表達恢復細胞的遷移和侵襲為了排除CRISPR-Cas9技術可能存在的脫靶效應，進一步證實PARP9在肺腺癌細胞遷移和侵襲中的作用，通過慢病毒感染在PARP9缺陷的A549細胞中恢復表達PARP9。以空病毒感染作為對照，使用Transwell小室檢測A549細胞的遷移和侵襲能力。Western blot結果表明（圖3A），慢病毒感染后，PARP9缺陷型A549細胞中PARP9表達恢復至與野生型細胞相當的水平。Transwell遷移和侵襲實驗結果表明（圖3B、3C），PARP9缺陷顯著減弱A549細胞的遷移和侵襲能力（遷移：t=11.250，P＜0.001；侵襲：t=4.916；P=0.001），恢復表達PARP9后，遷移和侵襲的減弱得以恢復（遷移：t=7.576，P＜0.001；侵襲：t=3.632；P=0.007），由此證實PARP9在調節肺腺癌細胞遷移和侵襲中的作用。

圖3 PARP9回復表達對肺腺癌細胞的遷移和侵襲能力的影響Fig 3 Effects of PARP9 reconstitution on the migration and invasion of lung adenocarcinoma cells

討 論

肺癌中非小細胞肺癌占比85%，肺腺癌和肺鱗癌是最常見的非小細胞肺癌亞型，肺腺癌占肺癌總數的40%，不同肺癌亞型具有不同的遺傳驅動因素和預后特征［14］。基因組學研究揭示了肺腺癌的驅動基因，如TP53、KRAS和EGFR等的突變，對肺腺癌診療具有重要的指導意義，推動了靶向治療進展［15］。本研究中，我們發現PARP9在肺腺癌組織表達上調且預后不良，使用同樣的數據庫分析時，肺鱗癌中PARP9的轉錄與預后相關性不顯著，提示PARP9可能與肺腺癌進展相關，該結果是否由不同肺癌亞型表達模式的差異導致，需通過規模化分析去驗證。

既往研究揭示了PARP9在一些實體瘤中的表達 與 作 用：Bachmann等［11］發 現 在 前 列 腺 癌 中PARP9參與調節細胞增殖與存活，Yang等［12］發現PARP9在乳腺癌中高表達并促進細胞遷移，也有研究通過數據挖掘發現PARP9表達與低級別膠質瘤的腫瘤微環境顯著相關，可能通過調控腫瘤微環境參與膠質瘤進展［16］。基于此，本研究首次探究了PARP9在肺腺癌中的表達與作用。通過數據庫與組織芯片樣本分析，我們發現PARP9在肺腺癌中上調表達，臨床病理特征相關性分析結果提示PARP9高表達預示更高的淋巴轉移風險。為了探究PARP9在肺腺癌中的生物學作用，我們構建了PARP9敲除與恢復表達的肺腺癌細胞株，通過Transwell實驗證明PARP9可以促進肺腺癌細胞的遷移與侵襲，該結果與組織樣本中PARP9高表達預示肺腺癌轉移高風險結果一致。

目前對于PARP9作用的分子機制的研究多與免 疫相關，PARP9參與IFN-γ信號傳導，調控 機體免疫應答，控制病毒感染［10，17］。免疫細胞中IFN-γ誘導PARP9的表達，PARP9通過刺激信號轉導與轉錄激活因子1（signal transducerand activator of transcription 1，STAT1）磷酸化影響下游信號［18-19］。STAT1在腫瘤中異常激活，參與腫瘤侵襲轉移、化療耐藥等過程，其表達在多種實體癌中具有預后價值［20-21］。有研究表明PARP9通過調控下游STAT1參與前列腺癌與DLB-CL的進展［11，19］，此 外，Xu等［22］對膠質瘤的研究中發現PARP9高表達患者體內存在多條免疫相關信號通路的富集，如JAKSTAT信號通路、Toll樣受體信號通路等。另有兩項報道指出PARP9在食管癌與宮頸癌中的表達受上游非編碼RNA的調控，進而影響細胞的致瘤性［23-24］。我們的研究表明PARP9在調控肺腺癌細胞遷移中發揮重要作用，可能與肺腺癌轉移相關，但具體的機制仍有待探究。TCGA數據庫的肺腺癌樣本中，與PARP9表達存在高度相關性的基因也主要與免疫相關，越來越多的研究揭示了免疫信號通路在肺腺癌轉移和預后中的重要作用［25-26］，PARP9是否會通過免疫相關信號參與對肺腺癌細胞遷移侵襲的調控仍有待探究。

本研究存在一些不足：首先是PARP9對肺腺癌細胞遷移侵襲能力影響的探究局限于細胞層面，我們曾嘗試進行裸鼠尾靜脈注射實驗進行體內遷移驗證，但注射后野生組與敲除組均未見轉移瘤，考慮細胞體內轉移能力較弱或未達到合適的實驗條件，仍需進一步摸索，我們采用兩個肺腺癌細胞株并進行恢復表達以驗證結果的可靠性；其次是對于PARP9調控肺腺癌細胞遷移和侵襲中的分子機制尚未明確，我們目前考慮通過生物信息學分析結合互作蛋白篩選進一步展開對PARP9在肺腺癌中作用的分子機制探索。

綜上所述，本項研究發現PARP9在肺腺癌組織中高表達，高表達PARP9的肺腺癌患者具有更短的總體生存期、更高的臨床分期且更易出現淋巴結轉移，在肺腺癌細胞中敲除PARP9后細胞的遷移和侵襲能力被顯著抑制，而恢復表達PARP9則恢復了肺腺癌細胞的遷移和侵襲能力。本研究指出PARP9與肺腺癌的進展相關，PARP9可能參與肺腺癌轉移，提示PARP9具有成為肺腺癌預測性生物標記物的可能，為進一步明確PARP9在腫瘤中的作用提供了新的理論依據。我們將繼續開展對PARP9作用的分子機制探索，以進一步明確PARP9在肺腺癌中的作用。

作者貢獻聲明鄭芬實驗設計和執行，數據整理和分析，論文撰寫和修訂。周曉敏實驗執行，論文撰寫和修訂。吳家雪實驗設計和指導，論文審閱和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。