胚系BRCA 1/2基因變異與乳腺癌患者臨床特征的關系

黃 斐 陳馨寧 郁 俐 姜惠琴 史庭燕 沈敏娜 張春燕，3△ 潘柏申，3 王蓓麗，3 郭 瑋，3，4

（1復旦大學附屬中山醫院檢驗科，2婦瘤科 上海 200032；3復旦大學附屬中山醫院廈門醫院檢驗科 廈門 361015；4復旦大學附屬中山醫院吳淞醫院檢驗科 上海 200940）

DNA損傷是導致腫瘤的誘因之一，DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSB）是最嚴重的損傷形式。在正常情況下，機體通過損傷修復通路來維持基因組的完整性和穩定性，其中同源重組（homologous recombination，HR）是DSB的主要修復方式。乳腺癌易感基因1（breast cancer gene 1，BRCA1）和乳腺癌易感基因2（breast cancer gene 2，BRCA2）是參與HR的重要基因。BRCA1/2基因變異會造成蛋白功能缺陷，導致基因組不穩定。攜帶胚系BRCA1/2基因變異（germlineBRCA1/2 mutations，gBRCAm）的個體終生罹患乳腺癌的風險顯著增加［1-2］。同時攜帶gBRCAm的乳腺癌患者對聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑更敏感［3-5］。攜帶gBRCAm的乳腺癌患者預后較差，無進展生存期和總生存期均低于未攜帶變異患者［6］。美國國家綜合癌癥網絡指南建議對乳腺癌患者進行常規gBRCAm檢測［2，7-8］。

BRCA1/2基因變異位點和類型較多，隨機分布于整條基因序列，無明確熱點。目前，多采用二代測序（next-generation sequencing，NGS）和多重連接依賴性探針擴增技術（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）檢測gBRCAm。BRCA1/2基因變異存在地域、種族和癌種的異質性，因此研究乳腺癌患者的BRCA1/2基因變異譜對風險評估、診療管理具有重要的意義。本文采用NGS檢測146例未經篩選的乳腺癌患者的gBRCAm，分析乳腺癌gBRCAm類型和分布情況，并探討其與臨床特征的關系。

資料和方法

研究對象選取2019年6月至2021年4月于復旦大學附屬中山醫院就診的146例乳腺癌患者。入組標準：經活檢或手術病理確診為乳腺癌。排除標準：（1）合并其他原發腫瘤；（2）轉移乳腺癌；（3）伴有其他全身性嚴重疾病的患者。其中男性患者2例，女性患者144例，中位年齡為（53.7±13.3）歲。本研究獲得復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準（批件號：B2021-056），且獲得患者知情同意。

胚系BRCA 1/2基因變異檢測采集146例患者EDTA-K2抗凝全血，采集到的2 mL全血按血液DNA核酸提取試劑盒（廈門艾德生物醫藥股份有限公司）說明書流程提取基因組DNA。采用Qubit dsDNA HS試劑（美國ThermoFisher公司）檢測DNA濃度，保證投入量為50 ng。根據BRCA1/2基因突變檢測試劑盒（廈門艾德生物醫藥股份有限公司）要求建庫。采用Qubit dsDNA HS和DNA 1000試劑（美國Agilent公司）對文庫質檢，要求濃度＞0.5 ng/μL，片段分布在260～400 bp，無明顯引物二聚體及雜峰。使用Miseq Dx和Miseq V2芯片測序（美國Illumina公司）。采用艾德“人類1/2基因高通量測序數據分析軟件”（v1.1.4）ADXHS-gBRCACNV模塊分析測序數據，獲得gBRCAm預分類結果。所有樣本滿足平均有效測序深度＞300，測序質量＞75%，比對率85%，覆蓋度100%。本檢測包括BRCA1基因（NM_007294.3）外顯子2、3、5～24以及BRCA2基因（NM_000059.3）外顯子2～27及外顯子-內含子連接區、UTR區（非翻譯區）和啟動子區的點突變和插入缺失突變。根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）遺傳解讀原則，基于人群數據、計算數據、功能數據、共分離數據等證據將變異分為5類，包括良性、疑似良性、意義不明確、疑似致病和致病變異，本文提及的gBRCAm為疑似致病和致病變異。對檢出的疑似致病或致病變異進行一代測序驗證。采用MLPA對分析軟件輸出的大片段重排（large rearrangement，LR）進行驗證。

臨床資料收集乳腺癌患者一般臨床資料和組織病理資料，包括發病年齡、確診時腫瘤發生部位、前哨和腋窩淋巴結狀態、組織學分級、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕酮受體（progesterone receptor，PR）和 人 表 皮 生 長 因 子 受 體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）。

統計學方法數據分析采用SPSS 23.0軟件。計數資料以率表示。采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗比較gBRCAm在乳腺癌中的分布，探討其與臨床特征的關系。所有均為雙側檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

胚系BRCA 1/2基因變異在乳腺癌中的分布在146例乳腺癌患者中，檢出18例患者攜帶gBRCAm，人群變異頻率為12.3%，其中8例發生BRCA1基 因 變 異，10例 發 生BRCA2基 因 變 異。在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中乳腺癌患者攜帶gBRCAm頻率為5.3%［9］。本研究中乳腺癌患者攜帶gBRCAm的頻率顯著高于TCGA數據庫報道（P=0.023），且攜帶BRCA1和2基因變異頻率分別為5.5%和6.9%，分布無明顯偏向（圖1）。

圖1 不同研究中乳腺癌患者攜帶gBRCAm的頻率Fig 1 Prevalence of gBRCAm from patients with breast cancer in different studies

胚系BRCA 1/2基因變異分布和類型特征94.4%（17/18）的變異發生于外顯子，僅5.6%（1/18）的變異發生于內含子剪接區。16.7%（3/18）的腫瘤患者攜帶的變異發生于BRCA1基因的外顯子11，38.9%（7/18）的腫瘤患者攜帶的變異發生于BRCA2基因的外顯子11，乳腺癌患者攜帶的變異多見于BRCA2基因的外顯子11。在檢出的18個不同變異中，移碼突變是最主要的變異類型（61.1%），無義突變、大片段重排和剪接突變比例分別為16.7%、11.1%和5.5%，檢出1例（5.5%）同義突變（圖2A）。BRCA1基因中檢出5種不同類型的變異，而BRCA2基因中僅檢出3種不同類型的變異（圖2B）。在BRCA1和BRCA 2基因上各檢出1例LR攜帶者，均為大片段缺失。在檢出的變異中，乳腺癌患者攜帶BRCA2基因c.5682C＞G的頻率最高，但未發現熱點或潛在始祖突變，其中NM_000059.3：c.6043_6055del13C為新發現變異，未見其他文獻和ClinVar數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）報道。變異在蛋白功能和結合域的分布如圖3A和3B所示，大部分變異發生于BRCA 1和BRCA 2蛋白的重要功能區和結構域上。

圖2 乳腺癌患者胚系BRCA 1/2基因變異類型和分布Fig 2 Variation type and distribution of gBRCAm in breast cancer patients

圖3 胚系BRCA 1/2基因變異在蛋白功能和結合域的分布Fig 3 Distributions of gBRCAm in functional domains and protein binding regions

胚系BRCA 1/2基因變異與乳腺癌臨床和病理特征的關系146例乳腺癌患者中，收集到94例患者的一般臨床資料和組織病理資料。在不同乳腺癌人群中胚系BRCA1/2基因變異情況存在差異，胚系BRCA1/2基因變異多見于早發乳腺癌（P＜0.001）、腫瘤家族史（P=0.008）、雙側乳腺癌（P=0.001）和三陰型乳腺癌（P=0.025），且BRCA1基因變異與三陰型乳腺癌發生密切相關（P=0.007，表1）。進一步分析發現胚系BRCA1/2基因變異與腫瘤分級（P=0.031）、PR狀態（P=0.040）和HER2狀態（P=0.039）相關，但與前哨和腋窩淋巴結轉移（P=0.048和0.085）和ER狀態（P=0.260）無關（表2）。在ER和PR陽性組中，攜帶BRCA2基因變異的乳腺癌患者顯著多于攜帶BRCA1基因變異的患者（P=0.041和P=0.026）。BRCA1基因變異攜帶患者中，三陰型和Luminal B型分別為75%和25%，而BRCA2基因變異攜帶患者中，57.1%為Luminal B型，28.6%為Luminal A型，14.3%為HER2表達型。

表1 不同乳腺癌人群中胚系BRCA 1/2基因變異情況Tab 1 Status of gBRCAm in breast cancer patients in different categories ［n（%）］

表2 乳腺癌患者胚系BRCA 1/2基因變異與腫瘤病理特征的關系Tab 2 Associations of clinicopathological characteristics with gBRCAm in breast cancer patients ［n（%）］

討 論

BRCA1/2基因屬于抑癌基因，其編碼蛋白參與DNA損傷修復、基因轉錄調控和細胞周期調節等多種細胞生命活動過程。基因功能缺陷會增加乳腺癌的發生風險。目前國內有多項針對乳腺癌患者BRCA1/2基因變異的研究，但不同研究中的BRCA1/2基因變異特征以及其與臨床特征間的關系存在一定差異［10-15］，這與入組患者的疾病背景差異有關，因此本中心希望通過區域性數據的積累和研究，建立區域化的BRCA1/2基因變異特征數據庫。本研究采用NGS檢測146例未經篩選的乳腺癌患者gBRCAm，分析乳腺癌gBRCAm類型和分布情況，研究其與臨床特征的關系，為患者的精準診療積累相關人群數據。

本研究中乳腺癌患者攜帶gBRCAm頻率為12.3%，高于數據庫報道和其他國內未經篩選的乳腺癌人群［10-13］。94.4%變異發生于外顯子區域，移碼變異、無義變異和大片段重排是最常見的致病和疑似致病的變異類型。檢出的大部分變異處于BRCA 1和BRCA 2蛋白的重要功能區和結構域。BRCA 1蛋白由N末端RING區（外顯子2～7）、多蛋白結合點和功能區（外顯子11～13）和C末端BRCT區（外顯子16～24）［16］。本研究中16.7%變異發生于BRCA1基因的外顯子11，該區域發生的變異可能影響BRCA 1蛋白參與DNA修復、細胞周期或核定位的功能，與早發乳腺癌和卵巢癌相關［14］。BRCA 2蛋白由DNA結合區、3個寡核苷酸結合區、塔 區、8個BRC重 復 區、N末 端PALB 2結 合 區 和C末 端RAD 51結 合 區 構 成［16］。38.9%變 異 發 生 于BRCA2基因的外顯子11，該區域發生的變異可能影響同源重組過程中其與RAD 51蛋白的相互作用［14］。研究顯示BRCA1基因發生LR多于BRCA2基因［17］，而本研究中在BRCA1基因和BRCA2基因各發生了1例LR，由于入組患者人數少未發現這種偏向。BRCA1基因發生LR多于BRCA2基因的主要原因在于Alu介導的HR是導致LR的主要機制，且BRCA1基因中Alu密度高于BRCA2基因［18-19］。女性罹患乳腺癌的風險隨BRCA1/2基因變異類型、發生位置改變而改變［20］。

本研究中40%攜帶gBRCAm的乳腺癌患者確診的平均年齡在35歲以下，低于未攜帶變異患者。低分化級別乳腺癌、三陰型乳腺癌和雙側乳腺癌患者多攜帶gBRCAm，在不同淋巴結狀態的患者中差異 無 統 計 學 意 義，與 其 他 研 究 報 道 一 致［10，15］。BRCA1基因變異在三陰型乳腺癌的比例高達33.3%；激素受體表達在攜帶gBRCAm的乳腺癌中差異較大。研究報道，BRCA1基因抑制ER在乳腺癌和前列腺癌細胞中的表達［21］，因此本研究中BRCA1基因變異傾向于ER、PR陰性表達，而BRCA2基因變異傾向于ER、PR陽性表達，而HER-2在亞組分析中傾向于陰性表達。

綜上，本研究通過NGS檢測中國區域性人群未經篩選的乳腺癌患者gBRCAm特征，研究gBRCAm與乳腺癌臨床特征的關系。本研究納入乳腺癌患者例數較少，gBRCAm組和不同突變亞組的例數較少，可能造成研究結果的偏倚；本研究為單中心研究，無法全面勾勒中國人群gBRCAm，僅能作為區域性特征的研究，因此需要多中心研究積累中國人群數據庫。我們正在不斷累積乳腺癌患者gBRCAm的數據，深入研究不同癌腫的變異圖譜，并聯合患者不同治療方式進行全面分析，以期為腫瘤患者個體精準診療和癌癥風險評估等奠定基礎。

作者貢獻聲明黃斐樣本檢測，數據統計，論文構思、撰寫和修訂。陳馨寧，郁俐樣本檢測。姜惠琴，史庭燕患者入組，臨床資料收集。沈敏娜樣本收集。潘柏申，王蓓麗，郭瑋研究指導。張春燕實驗設計，論文修改和指導。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。