TRPV1/TRPA1對小鼠子宮內膜異位癥炎癥及疼痛的作用

朱 海 王 一 賀奕博 俞衛鋒

（1海軍軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院麻醉科 上海 200438；2上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院麻醉科 上海 200127；3上海市普陀區婦嬰保健院病理科，4麻醉科 上海 200062）

子宮內膜異位癥（以下簡稱內異癥）是一種常見的、以疼痛為典型癥狀的婦科臨床疾病，通常伴有不孕癥。子宮內膜異位病變組織和腹膜液中存在由一系列炎癥細胞、細胞因子和趨化因子的異常改變而形成的炎癥微環境［1-2］。內異癥引起的疼痛可能與內異癥病灶周期性出血引起的局部炎癥反應、病灶異常生長導致的外周神經和中樞神經敏感引起的疼痛敏化以及腹腔內慢性炎癥相關［3］。多項研究顯示，來自炎癥性子宮內膜病變的持續傷害導致了感覺傳入的持久中樞敏化［4-5］。目前，內異癥引起疼痛的具體機制尚不清楚。瞬時受體電位香草酸1（transient receptor potential cation channel subfamilyⅤmember 1，TRPV1）在結構上與有毒熱感和電壓門控鈣、鈉、鉀通道有關［6］。瞬時受體電位錨定蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）為TRPV1的受體，在結構上與非選擇性陽離子通道相關，主要位于辣椒素敏感的肽感覺神經元上［7］。TRPA1作為細胞損傷信號的傳感器，參與炎癥和免疫反應，在刺激（癢）或疼痛的感覺中介導物理和化學刺激的轉換［8］。TRPV1與類風濕關節炎、骨關節炎和腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）等導致的慢性疼痛疾病相關［9］，可增強和整合對疼痛誘導刺激的反應，如酸中毒、氧化應激或炎癥介質［10］。TRPV1/TRPA1異構體在感知環境危害以及增強炎癥疼痛感方面發揮重要作用，可以促進持續性疼痛［11］。Fattori等［12］研究顯示，內異癥疼痛模型小鼠的病變組織中存在降鈣素基因相關肽、TRPA1和TRPV1表達的神經纖維。內異癥還可激活表達TRPA1和TRPV1的背根神經節神經元（nuclear factor kappa B subunit 1，NF-κB）中的信號通路。

本研究擬通過植入的方法建立小鼠內異癥模型，聯合TRPA1激動劑肉桂醛（cinnamaldehyde）和TRPA1拮 抗 劑HC-030031，探 討TRPA1/TRPV1異聚體在小鼠內異癥子宮內膜組織中的表達情況，分析TRPA1/TRPV1異聚體與內異癥縮宮素介導疼痛的相關性，同時驗證TRPA1和TRPV1對炎癥因子的影響作用。

材料和方法

試劑及儀器戊酸雌二醇、縮宮素［阿拉丁試劑（上海）有限公司］，Cinnamaldehyde、HC030031（美國Sigma-Aldrich公司），TRPV1、TRPA1多克隆抗體（德國Novus公司），β-actin抗體（英國Abcam公司），反轉錄試劑盒（加拿大Fermentas公司），HiScript Reverse Transcriptase（RNase H）和SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），RIPA裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制劑（美國Thermo公 司），小 鼠IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2 ELISA檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。實時熒光定量PCR儀（型號：QuantStudio 6，美國ABI公司），正置熒光顯微鏡（型號：Eclipse C1，日本Nikon公司），水平電泳儀（型號：JY300，北京君意東方電泳設備有限公司）。

內異癥模型建立及動物分組28只BALB/c雌性小鼠（8周齡，18～21 g）購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證：SCXK（滬）2017-0005。所有動物實驗經上海市普陀區婦嬰保健院倫理委員會批準，批準號：2016倫審第（1）號。實驗時間為2017年10月至2018年10月，動物均在SPF級環境飼養，12 h/12 h光暗周期。將28只小鼠隨機選取8只作為供體組，造模前1周供體組皮下注射戊酸雌二醇（0.2 mg/只），1周后對小鼠實施安樂死后將其以仰臥位固定于手術臺，沿正中線剖開腹腔，分離雙側子宮系膜，除去漿膜和子宮肌層，生理鹽水反復漂洗，去除子宮表面的血跡，分離子宮系膜，在生理鹽水中切碎子宮內膜（碎片≤1 mm3），全程保持無菌操作，將切碎的子宮內膜經18號針頭注射到實驗組小鼠腹腔內。取臍下偏正中線處的左下腹為進針點（0.5 mL/只），1只供體小鼠對應2只受體小鼠，構建內異癥小鼠模型，每個模型操作時間限制為5 min［13］。

將20只實驗組小鼠分為4組：假手術組（Sham）、模 型 組（Model）、肉 桂 醛+模 型 組（Model+Cinnamaldehyde）和TRPA1拮抗劑+模型組（Model+HC030031），每組5只。內異癥小鼠模型建立1天后，模型組給予灌胃溶劑；肉桂醛+模型組給予灌胃肉桂醛（10 mg/kg），每3天1次；TRPA1拮抗劑+模型組給予灌胃HC-030031（2.5 μg/kg），每天1次。給藥2周，繼續飼養2周。稱重、處死并解剖小鼠，取異位子宮內膜病灶，收集血清和腹腔灌洗液。

疼痛行為學建模（給藥）后7、14、21和28天腹腔注射縮宮素20 IU/kg，觀察30 min內出現的扭體反應，記錄扭體次數。

實時熒光定量PCR檢測小鼠子宮內膜組織中TRPV1/TRPA1的基因表達取100～200 mg組織塊，研缽里磨碎（加液氮輔助），磨碎的組織放入1.5 mL無RNA酶EP管 中，加 入1 mLTrizol浸 泡，混合均勻，用于抽提或-20℃凍存。按照Trizol提取試劑使用說明抽提組織中的總RNA，根據操作說明書RNA反轉錄成cDNA。根據目的基因序列信息設計并合成qPCR檢測引物（表1）。

表1 RT-PCR檢測引物信息表Tab 1 Primer sequence for RT-PCR

以反轉錄的cDNA為模板，用目的基因特異性引物和內參引物擴增待檢測的目的基因片段和看家基因，將樣品放入IQ5熒光定量PCR儀，SYBR Green法熒光定量PCR以分析各基因的表達，用ΔΔCt法定量各基因的相對表達。

免疫熒光檢測小鼠子宮內膜組織中TRPV1/TRPA1蛋白表達和定位小鼠子宮內膜組織經多聚甲醛固定、脫水和石蠟包埋后切片（5 μm）。切片脫蠟后進行抗原修復，PBS洗滌3次，每次5 min。切片上滴加BSA，室溫孵育1 h。去除封閉液，切片上滴加PBS配備的一抗，分別孵育抗體TRPA1（1∶500）和TRPV1（1∶500）。切片平放于 濕盒內4℃孵育過夜。次日，置于PBS（pH=7.4）中脫色，PBS洗滌3次，每次5 min。切片干燥后在圈內滴加與一抗相應種屬的熒光標記二抗覆蓋組織，室溫孵育1 h。于PBS中脫色，洗滌3次，每次5 min。切片干燥后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。用抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察切片并采集圖像。

ELISA檢測小鼠血清及腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的表達稱取標本，加入PBS，用液氮迅速冷凍，保存備用。標本融化后保持2～8℃，加入PBS，勻漿充分，2 000～3 000×g離心20 min，收集上清。按ELISA試劑盒說明書進行樣品檢測，計算細胞因子濃度。

Western blot檢測小鼠子宮內膜中TRPV1/TRPA1的蛋白表達用PBS清洗小鼠子宮內膜組織，加適量液氮研磨，充分研磨后將組織勻漿轉移至離心管；加入RIPA蛋白裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制劑200 μL裂解蛋白，混勻冰浴40～60 min；4℃下11 000×g離心15 min，提取蛋白裂解液上清；采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）測定蛋白質濃度；根據濃度測定結果對蛋白濃度進行調整，保證不同組別間蛋白濃度一致；用樣品將6×上樣緩沖液稀釋成1×上樣緩沖液，煮沸5 min，于-80℃保存；蛋白用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）12%分離膠（5%濃縮膠）電泳分離，電泳，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜轉膜，一抗孵育，增強型化學發光劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，凝膠電泳儀成像，用Image J軟件進行條帶灰度分析。

統計學分析各組樣本qPCR檢測至少重復3次，數據用Graphpad Prism 8.0軟件分析；免疫熒光相對定量用Image-Pro Plus軟件分析。Western blot結果用Image J（USA）軟件分析。兩組間差異分析用非配對t檢驗；3組及以上的組間差異比較用單因素方差分析。結果用±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

內異癥小鼠疼痛行為學實驗建立小鼠內異癥模型，探討TRPV1/TRPA1異構體在內異癥疼痛中的作用，并在小鼠體內進行催產素誘導的扭體實驗（表2）。催產素誘導的內異癥小鼠扭動頻率相比對照組顯著增加，肉桂醛進一步放大了這一現象，HC-030031則減弱了內異癥小鼠的扭動頻率。

表2 子宮內膜異位癥小鼠扭體實驗數據Tab 2 Number of body-twisting frequency in mice with endometriosis （±s）

表2 子宮內膜異位癥小鼠扭體實驗數據Tab 2 Number of body-twisting frequency in mice with endometriosis （±s）

（1）vs.Sham group，P＜0.01；vs.Model group，（2）P＜0.05，（3）P＜0.01.

Group Sham Model Model+Cinnamaldehyde Model+HC-030031 28 d 4.8±2.2 26.0±2.1（1）35.2±6.2（1）（2）17.2±5.3（1）（2）0 d 5.6±1.1 22.8±4.9（1）23.0±1.2（1）20.8±3.7（1）7 d 4.8±1.3 23.6±3.5（1）30.0±3.5（1）（2）21.0±2.2（1）14 d 6.2±1.6 25.2±3.3（1）31.2±3.7（1）（2）16.4±2.7（1）（3）21 d 4.6±1.1 25.8±2.3（1）34.2±5.8（1）（2）17.0±4.2（1）（2）

qPCR檢測小鼠子宮內膜TRPV1/TRPA1 mRNA表達qPCR檢測小鼠子宮內膜組織中TRPV1/TRPA1 mRNA表達結果如圖1所示。與假手術組相比，模型組，肉桂醛+模型組以及TRPA1拮抗劑+模型組的TRPV1 mRNA表達顯著上調；肉桂醛和HC-030031對模型組TRPV1 mRNA表達的作用不顯著（圖1A）。與假手術組相比，模型組、肉桂醛+模型組的TRPA1 mRNA表達顯著上調；肉桂醛顯著上調模型組的TRPA1 mRNA表達，而HC-030031顯著抑制模型組的TRPA1 mRNA表達（圖1B）。

圖1 各組小鼠子宮內膜組織中TRPV1/TRPA1 mRNA表達Fig 1 Expression of TRPV1/TRPA1 mRNA in endometrial tissues of mice in each group

Western blot檢測小鼠子宮內膜組織中TRPV1/TRPA1蛋白表達與假手術組相比，模型組、肉桂醛+模型組和TRPA1拮抗劑+模型組的TRPV1蛋白表達顯著上調；肉桂醛和HC-030031對模型組TRPV1蛋白表達的作用不顯著（圖2A、2B）。與假手術組相比，模型組、肉桂醛+模型組的TRPA1蛋白表達顯著上調，肉桂醛顯著上調模型組的TRPA1蛋白表達，而HC-030031顯著抑制模型組TRPR1蛋白表達（圖2A、2C）。

圖2 各組小鼠子宮內膜組織中TRPV1/TRPA1蛋白表達Fig 2 Protein level of TRPV1/TRPA1 in endometrial tissues of mice in each group

ELISA檢測各組小鼠血清及腹腔沖洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的含量與假手術組相比，模型組小鼠血清（圖3A～3D）以及腹腔沖洗液（圖3E～3H）中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的 含量顯著升高；肉桂醛進一步促進上述作用，而HC-030031顯著抑制模型組小鼠血清以及腹腔沖洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的含量升高。

圖3 ELISA檢測各組小鼠外周血和腹腔灌洗液的炎性因子含量Fig 3 Concentrations of inflammatory cytokines in serum and peritoneal irrigation fluid of mice in each group

免疫熒光檢測各組小鼠子宮內膜組織中TRPV1/TRPA1蛋白表達共定位如圖4所示，肉桂醛+模型組小鼠內異癥組織中TRPV1伴TRPA1蛋白含量最高；與假手術組相比，模型組小鼠的TRPV1/TRPA1共表達顯著上調；TRPA1拮抗劑+模型組及假手術組小鼠的TRPV1/TRPA1蛋白表達最低，這提示TRPV1/TRPA1異構體可能與小鼠內異癥疼痛呈正相關。

圖4 免疫熒光檢測各組小鼠子宮內膜組織中TRPV1/TRPA1蛋白表達共定位Fig 4 Co-localization of TRPV1/TRPA1 protein expression in endometrial tissues of mice in each group

討 論

內異癥是一種雌激素依賴性炎癥性疾病，疼痛為內異癥患者主要的臨床癥狀之一，即使經過治療，疼痛仍然持續。內異癥相關疼痛的多種機制包括痛覺敏化、炎癥和外周和中樞神經系統疼痛處理的改變。免疫細胞分泌的細胞因子（如IL-1β、IL-6和TNFα等）分布在腹膜液中可能對內異癥起到促痛劑的作用，直接引起TRPV1通道的興奮性改變，使得周圍神經敏感，或引發復雜的反饋作用，放大微環境炎癥反應和疼痛的產生［14］。TRPV1和TRPA1是在炎癥信號通路中起關鍵作用的陽離子通道，在內異癥相關疼痛中的作用機制尚未可知。我們通過構建內異癥小鼠模型，結合TRPA1抑制劑和激動劑，分析TRPA1/TRPV1異聚體對內異癥小鼠疼痛和炎性因子的影響，為內異癥相關疼痛的治療提供科學依據。

本研究結果顯示，TRPV1/TRPA1異構體在內異癥小鼠中表達上調；TRPA1激動劑肉桂醛對內異癥引起的小鼠疼痛的減輕作用較小；TRPA1抑制劑HC-030031對內異癥引起的小鼠疼痛的減輕作用更為顯著，說明TRPV1/TRPA1異構體的形成可能與內異癥小鼠縮宮素誘導的疼痛有關。肉桂醛進一步促進內異癥小鼠血清及腹腔灌洗液炎癥因子含量，而HC-030031則對其有顯著抑制作用，提示TRPV1/TRPA1異聚體可能有利于感知響應炎癥微環境，進行信號傳導，增強疼痛感。

研究表明，抑制TRPV1和TRPA1通道可通過線粒體裂變/融合蛋白抑制Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB和NLR家 族Pyrin域 蛋白3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）/caspase-1通路起到抗肺部炎癥的作用［15］。另一項研究得出類似結果，即TRPV1和TRPA1通道抑制劑能夠減少脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠急性肺損傷［16］。TRPA1以 及TRPV1在結構上與非選擇性陽離子通道相關，主要位于辣椒素敏感肽能感覺神經元［7］。TRPV1和TRPA1通道可以響應炎癥因子、熱刺激物等，被激活后可將外周信號傳輸到中樞等多通道，從而誘導啟動慢性炎癥疾病的免疫系統反應［17］。TRPV1和TRPA1在感知環境危害以及增強炎癥疼痛感方面發揮重要作用。研究證實TRPV1-TRPA1相互作用可能形成主要依賴于鈣離子的異質通道［18］。跨膜蛋白100與TRPA1和TRPV1共表達并形成復合物，選擇性增強TRPA1活性，并削弱TRPA1和TRPV1的關聯，而TRPA1和TRPV1是關鍵的疼痛 介 質［11］。包 括TRPV1和TRPA1在 內的 瞬 時 感受器電位通道已成為炎癥性疼痛的潛在傳感器和轉導器。TRPV1/TRPA異聚體調節內異癥疼痛的潛在機制需進一步體內外研究證明［19］。

研究顯示，內異癥可分為免疫優勢期和激素優勢期兩個階段。內異癥的早期起始階段（72 h以內）在很大程度上受到先天免疫系統的調控。在內異癥早期的動物模型中，炎癥因子和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的mRNA和蛋白水平均升高，但這種變化與雌二醇治療無關。同時炎癥細胞通過非內質網依賴的方式被招募到腹腔。子宮內膜異位早期階段免疫系統信號主導雌二醇介導的信號，隨后可能出現激素占主導地位的發展階段［20］。Krisztina等［20］研究發現，雌激素可能通過調節炎癥細胞因子巨噬細胞遷移抑制因子而上調大鼠子宮內膜組織中TRPA1和TRPV1的表達。本研究表明內異癥小鼠外周血和腹腔灌洗液炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的含量增加，TRPA1抑制劑HC-030031顯著抑制炎性因子的表達，尚缺乏TRPA1和TRPV1在臨床內異癥樣本中的表達數據以及細胞功能驗證。因此，需要進一步的體外研究證實TRPA1/TPPV1異聚體和炎性因子在內異癥疼痛發展的相互作用關系。

綜上所述，本研究初步探討了小鼠內異癥模型中TRPV1/TRPA1在內異癥相關疼痛中的作用，TRPV1/TRPA1表達水平可以作為評估內異癥相關疼痛程度的參考，靶向TRPV1/TRPA1異聚體可能成為治療內異癥疼痛的選擇之一。

作者貢獻聲明朱海實驗操作，數據收集，論文撰寫。王一，賀奕博數據統計和分析，論文修訂。俞衛鋒研究設計和指導，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。