共培養條件下大鼠骨髓間充質干細胞分化為胰島樣細胞團的研究

劉鑫 岑妍慧 賈微 楊瑞 李森 姜娜 黃澤萍 寧志瑩 黃威

廣西中醫藥大學組織學與胚胎學教研室，南寧 530200

糖尿病是影響人類健康的主要疾病之一，除外源性胰島素治療外，胰島移植是目前較理想的治療方法，但面臨胰島供體短缺、移植排斥和手術后遺癥等問題，制約了其在糖尿病治療領域的臨床應用。因此尋找可替代的其他來源的胰島β細胞成為近年研究的熱點。干細胞誘導分化為胰島細胞是目前重要的研究方向之一，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是骨髓中除造血干細胞以外的另一種多能干細胞，既可分化為造血組織，又可分化為造血以外的組織細胞，取材方便，容易進行體外分離、培養和純化。目前一些研究均表明特定的誘導劑或培養體系可使BMSCs定向分化為胰島細胞[1-3]，也有研究者使用共培養體系對BMSCs進行誘導分化[4-5]，但其主要探討共培養體系對BMSCs功能改變的影響，而對于誘導過程中BMSCs形態變化的動態觀察、胰島素分泌量、表達特征及超微結構的變化等方面未見有關報道。本研究將大鼠胰島細胞與BMSCs共培養作為誘導體系，最大程度模擬類似胰腺的微環境，探討BMSCs在與胰島細胞共培養后分化為胰島樣細胞團的可能性，以期為胰島移植的臨床應用奠定基礎。

材料與方法

一、BMSCs的分離、純化與鑒定

健康SPF級成年Wistar大鼠12只，購自廣西中醫藥大學實驗中心(動物許可證號：桂醫動字第11004號)。無菌條件下取大鼠的股骨及脛骨，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養液沖洗骨髓腔獲取骨髓(DMEM培養液、胎牛血清均購自美國Hyclone公司)，稀釋后加入淋巴細胞分離液(比重1.077 kg/L)離心，吸取白膜層細胞，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養液進行培養。待細胞鋪滿瓶底70%～80%面積時，使用2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞，流式細胞儀檢測BMSCs表面標志物CD44和CD90；行成骨方向誘導分化及成脂肪方向誘導分化，以明確BMSCs的干細胞性質和特性。誘導分化具體操作：取第5代細胞，更換為成骨誘導培養液(10%胎牛血清的低糖DMEM，1×107mmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 μg/ml維生素C)，連續誘導培養4周后細胞行茜素紅染色；或更換為成脂肪誘導培養液(10%胎牛血清的高糖DMEM，1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、100 μmol/L吲哚美辛和10 mg/L胰島素)，連續誘導培養4周后細胞行油紅O染色。

二、胰島的分離、純化和鑒定

向大鼠膽總管內逆行注入濃度為1 mg/ml的V型膠原酶消化胰腺，將獲得的細胞懸液使用Percoll不連續密度梯度離心法獲取胰腺內分泌部的細胞團——胰島，將其懸浮于完全培養液(DMEM培養基、15%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺、4 U/ml肝素)中，接種于96孔培養板，置37℃、5% CO2培養箱培養28 d，倒置相差顯微鏡下觀察胰島的細胞形態和生長狀況。取胰島細胞懸液與雙硫腙溶液混勻，室溫下放置10 min，因雙硫腙可與胰島β細胞胞質內分泌顆粒中的鋅離子螯合使胰島β細胞的胞質呈鐵紅色，故在倒置相差顯微鏡下計算每個胰腺的胰島數。

采用ELISA法檢測胰島細胞培養液的基礎胰島素水平，試劑盒購自美國Bioswamp公司；取完全培養基培養2 d的胰島細胞，棄培養液，用PBS清洗后，分別加入含葡萄糖5.6 mmol/L(低糖)和25.0 mmol/L(高糖)的培養液繼續培養2 h，收集培養液，采用ELISA法檢測胰島素釋放量。

三、與胰島共培養條件下BMSCs的誘導分化

取第5代BMSCs和純化的胰島細胞，隨機分為干細胞單獨培養組(干細胞組)、干細胞-胰島細胞共培養組(共培養組)和胰島細胞單獨培養組(胰島組)。各組細胞均采用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養液培養，誘導28 d后進行檢測。(1)形態學特征：倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態學特征和生長特性。(2)基礎胰島素水平：采用ELISA法檢測培養液中的基礎胰島素水平。(3)胰島素釋放量：采用ELISA法檢測胰島組和共培養組培養液中的胰島素釋放量。(4)胰島樣細胞團胰島素的表達：采用免疫細胞化學染色法檢測共培養組誘導形成的胰島樣細胞團胰島素蛋白表達情況。胰島素抗體購自美國Bio-Rad公司，抗胰島素多克隆抗體工作濃度為1∶200。最后蘇木精復染、封片。以細胞質內出現棕黃色為胰島素陽性細胞。(5)胰島樣細胞團超微結構：取共培養組誘導形成的胰島樣細胞團，去誘導液，用消毒好的細胞刮將細胞團刮下，低速離心(1 000 r/min，10 min)，收集細胞團，去上清，沿壁小心加入新鮮的 2%戊二醛固定液，制備超薄切片，置透射顯微鏡下觀察細胞團的超微結構。

四、統計學處理

結 果

一、大鼠BMSCs的形態學特征及生物學特性

培養7 d后BMSCs形成明顯集落，集落呈漩渦狀或輻射狀，細胞形態比較一致，胞體為長梭形，核呈橢圓形，有1～2個核仁(圖1A)。細胞表面抗原標志物CD44、CD90的陽性率分別為99.48%、99.50%(圖1B、1C)。成骨誘導結果發現，經誘導分化后，細胞由長梭形變成立方形或矮柱狀，伸出許多細胞突起，一些突起互相連接；細胞外出現大量鈣鹽沉積，并形成多個鈣結節(圖2A)；茜素紅染色顯示鈣結節呈紅色(圖2B)。成脂肪誘導結果發現，細胞形態開始變短、變圓，細胞胞質內形成許多高折光性的脂滴，部分脂滴融合、增大(圖2C)；油紅O染色顯示脂滴呈紅色(圖2D)。提示成功分離、純化出原代BMSCs，且BMSCs具有成骨、成脂多向分化能力。

圖1 BMSCs形成的集落呈螺旋狀或輻射狀(1A，×20)及流式細胞儀檢測表面標志物CD44(1B)和CD90(1C)

圖2 成骨誘導后BMSCs形成多個鈣結節(2A，×40)，茜素紅染色鈣結節呈紅色(2B，×40)，成脂肪誘導后BMSCs細胞胞質內出現多個脂滴(↑，2C，×40)，油紅O染色脂滴呈紅色(↑，2D，×40)

二、大鼠胰島的形態學特征、產量、純度及其生物學活性

培養3 d時，胰島懸浮狀生長(圖3A)，呈圓形或橢圓形；培養4～5 d時，胰島開始貼壁生長，有折光性，立體感強(圖3B)；培養14 d時，部分胰島開始出現凋亡征象，但結構仍完整；培養20 d時，可見有少量胰島結構變松散，邊界不清；培養至28 d時，僅有少量完整胰島，大部分胰島細胞凋亡。

雙硫腙染色顯示胰島中β細胞呈棕紅色，經計數，每個胰腺可獲得胰島約450個，平均純度達80%(圖3C)。

圖3 培養第3天(3A，×20)，第5天(3B，×40)的胰島及雙硫腙染色的胰島(3C，×20)

胰島單獨培養時，第3天胰島素分泌量高于第1天，4～5 d時達到培養過程中胰島素分泌的高峰值，隨后胰島素分泌逐漸下降，培養至第13天，胰島素分泌量約降為最高值的20%(圖4)。低糖組和高糖組胰島的胰島素釋放量分別為(7.105±1.551)mIU/ml和(20.231±1.592)mIU/ml，差異有統計學意義(P﹤0.05)。

圖4 胰島的基礎胰島素分泌量

三、BMSCs誘導分化成胰島細胞

干細胞組細胞一直保持BMSCs典型的形態學特征，未見明顯改變，即細胞集落呈漩渦狀或輻射狀，胞體為長梭形，核呈橢圓形(圖5A)；胰島組胰島在培養中始終成團塊狀散落并貼壁生長，立體感強，未見明顯改變(圖5B)；共培養組培養7 d后見局部干細胞開始聚攏，同時較多分裂產生的細胞以出芽的方式向上生長成小團塊狀(圖5C)，培養14 d左右形成球形的胰島樣胞團結構，并以較細長的蒂部與瓶底連接，漂浮于培養液中(圖5D)，隨著共培養時間的延長，胰島樣細胞團仍保持良好的生長狀態，并不斷增大，團塊狀更明顯(圖5E)，直至共培養至第28天仍可見胰島樣細胞團生長情況良好。

圖5 各培養組細胞的形態學特征。5A 干細胞組細胞的形態未見明顯改變(×20)；5B 胰島組的胰島成團塊狀貼壁生長(×20)；5C 共培養組的局部干細胞聚攏成小團塊(↑，×20)；5D 胰島樣細胞團結構以較細長的蒂部與瓶底連接(↑，×40)；5E 胰島樣細胞團生長增大成明顯團塊狀(×20)

基礎胰島素水平測定結果顯示，干細胞組培養液的基礎胰島素分泌量均<0.5 mIU/L(低于試劑盒所能檢測的最低濃度)，故無法測出；胰島組第5天胰島素分泌達峰值，隨后逐漸下降，至第13天，胰島素分泌量約降至最高值的20%(圖6)；共培養組胰島素水平在培養第5天達到峰值，第13天仍維持在峰值水平的40%左右。培養第8、10、13天，共培養組的基礎胰島素分泌量顯著高于胰島組，差異有統計學意義(P值均<0.05，圖6)。

圖6 共培養組和胰島組的胰島素分泌量

胰島素釋放結果顯示，5.6 mmol/L低糖和25.0 mmol/L高糖刺激下，胰島組的胰島素釋放量分別為(7.105±1.551)mIU/ml和(20.231±1.592)mIU/ml，共培養組誘導形成的胰島樣細胞團胰島素釋放量分別為(7.008±1.429)mIU/ml和(20.561±1.547)mIU/ml，差異無統計學意義(P值均﹥0.05)。

培養14 d，共培養組的胰島樣細胞團胞質中出現大量棕黃色顆粒，分布較均勻，表明誘導分化形成的胰島樣細胞團胞質內含有胰島素(圖7)。電鏡下見胰島樣細胞團胞質中出現分泌顆粒和粗面內質網，體現胰島樣細胞團具有蛋白質分泌能力，提示BMSCs有朝胰島β細胞分化的趨勢(圖8)。

圖7 共培養組的胰島樣細胞團中有胰島素表達(呈棕黃色，↑，×40) 圖8 共培養組的胰島樣細胞團胞質內可見分泌顆粒(紅↑)和粗面內質網(黑↑，×40 000)

討 論

細胞共培養技術發展于20世紀70年代后期，多項研究表明將成熟體細胞與干細胞共培養可以誘導干細胞定向分化[7-8]，這是因為干細胞所處的微環境對于其分化起調節作用，即干細胞的分化受微環境中細胞與細胞、細胞與細胞外基質間相互作用的影響，在特定的微環境中通過與其他細胞、細胞基質及各種細胞因子、激素的相互作用，可以調控干細胞分化的某些關鍵基因的表達，決定其分化的方向[9]，所以共培養條件下干細胞可分化為所處微環境的成熟體細胞[10-11]，且這種方法在很多領域均有成功報道[12-13]。關于BMSCs的共培養分化研究，早期多是探討BMSCs對與其共培養細胞的功能發育方面的影響，如BMSCs與皮膚成纖維細胞共培養，能使皮膚成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞[14]；BMSCs與軟骨細胞共培養，能促進軟骨細胞表型維持等[15]。近年關于與BMSCs共培養的細胞是否能影響BMSCs分化的研究開始逐漸增多。徐麗麗等[16]用Transwell小室建立了BMSCs與神經細胞共培養體系，利用神經細胞分泌的物質來誘導BMSCs分化為神經樣細胞；還有研究者將BMSCs與髁突軟骨細胞共培養，共培養的髁突軟骨細胞與同代單獨培養的髁突軟骨細胞相比，前者增殖能力增強，軟骨細胞特征性蛋白分泌活躍，表明髁突軟骨細胞誘導 BMSCs 向軟骨細胞方向分化的同時，還有利于髁突軟骨細胞表型的維持和促進軟骨細胞增殖[17]。有關利用共培養體系將BMSCs誘導分化成胰島，目前國內主要有2008年沈浩亮等[18]和2010年李偉娟等[19]的研究，他們均發現BMSCs與胰島細胞共培養后可以被誘導分化為胰島樣細胞。這些研究均運用Transwell小室設置共培養體系,且主要觀察共培養體系對BMSCs功能改變的影響，而對于誘導過程中BMSCs形態、結構和表達特征變化等方面還未見有關報道。

本研究則是基于以上認識，將純化的BMSCs與成年大鼠胰島“直接”共培養，利用胰島細胞作為“誘導劑”，最大程度模擬類似胰腺的微環境，通過動態跟蹤觀察干細胞和胰島細胞在共培養過程中的形態、結構變化，觀察和檢測誘導形成的胰島樣細胞的內部超微結構和表達特征，結果證實本研究所獲得BMSCs是單一的細胞群，不含造血系細胞, 具有多向分化潛能，符合典型的BMSCs特征，是可靠的細胞模型；與其共培養的胰島經雙硫腙染色呈陽性，說明其胞質內富含鋅離子，具有胰島細胞的特性；兩種細胞共培養的過程中，與同代單獨培養的干細胞相比，BMSCs在共培養后逐漸失去典型的長梭形和呈漩渦狀或輻射狀的生長特征，而以出芽的方式向上生長成小團塊狀，直至最后形成球形的胰島樣胞團結構，說明BMSCs向胰島細胞方向分化；而基礎胰島素水平測定結果表明共培養體系中誘導形成的胰島樣細胞團具有分泌胰島素的功能，且共培養條件能有效維持誘導分化形成的胰島樣細胞團的胰島素分泌量，使之持續保持在較高水平；此外通過ELISA檢測發現在不同糖濃度刺激下，誘導形成的胰島樣細胞團胰島素釋放量能隨著葡萄糖刺激濃度的增高而增加，且該細胞團胰島素釋放量與單獨胰島的胰島素釋放量的差異無統計學意義，表明誘導形成的胰島樣細胞團具有較成熟的胰島素釋放功能；進一步免疫細胞化學染色法檢測了胰島樣細胞團的胰島素表達情況，與ELISA法的實驗結果相吻合；最后透射電鏡觀察胰島樣細胞團的內部結構，發現其細胞胞質內出現較多的分泌顆粒和粗面內質網，體現了較活躍的蛋白質分泌能力，提示胰島樣細胞團具有較成熟的結構和功能，證實了細胞共培養方法可以使BMSCs隨著微環境的改變而向胰島樣細胞團分化。

關于共培養中細胞之間作用的機制目前尚不十分清楚。推測是微環境中細胞與細胞、細胞與細胞外基質間、細胞基質及各種細胞因子、激素的相互作用等參與了BMSCs的生存和分化，使之發生環境依賴性變化，但具體的信號轉導及途徑尚不明確，且細胞共培養技術仍不能完全反映體內環境的變化，共培養體系的條件如培養液pH值、細胞培養時間和種植密度等仍需要進一步完善。因此，逐步完善細胞共培養技術以及共培養誘導分化形成的胰島樣細胞團移植后能否長期保持分泌胰島素的能力，從而更好的發揮降糖作用，都是亟待解決的問題。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明劉鑫：研究操作、論文撰寫；李森、黃澤萍、寧志瑩、黃威：數據整理、統計學分析；岑妍慧、賈微、楊瑞、姜娜：研究醞釀、研究指導、工作支持；岑妍慧、賈微：研究設計、研究指導、論文修改、經費支持