酶底物法檢測醫療機構廢水中糞大腸菌群的適用性分析

林 健

(福州市臺江環境監測站，福建 福州 350004)

0 引言

糞大腸菌群是指具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，它不是按細菌分類學命名，而是衛生細菌領域的用語，指的不是某一種或某一屬細菌，而是一類生長于人和溫血動物腸道中的一組細菌，能夠適應較高的培養溫度，是總大腸菌群中的一部分，主要來自糞便[1]。北美國家的研究文獻著重強調其糞性來源，多使用“糞大腸菌群”的叫法，而歐洲國家則強調其對溫度的耐受性方面特點，能夠適應較高的培養溫度，稱其為“耐熱大腸菌群”。我國對它的定義隨著標準和檢測方法的不同而變化，《水和廢水監測分析方法》(第四版)對糞大腸菌群的定義為“在44.5℃溫度下能生長并發酵乳糖產酸產氣的大腸菌群”；酶底物檢測法則利用其方法原理，將糞大腸菌群定義為“44.5℃培養24小時，能產生β-半乳糖苷酶，分解選擇性培養基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌”。

醫療污水指醫療機構門診、病房、手術室、各類檢測室、病理解剖室、放射室、洗衣房、太平間等處排出的診療、生活及糞便污水，當醫療機構其他廢水同上述污水混合排出時一律視為醫療機構污水[2]。不同于其他污水，醫療廢水成分復雜，含有大量細菌、病毒等微生物，具有一定的傳染性和細胞毒性。在實際工作中，對水體所有可能的致病微生物進行檢測不太現實，一般會選擇檢測某一類具有代表性的微生物作為指示菌，以反映水體被污染的程度。而醫療廢水中的糞大腸菌群可以作為一種特征指示菌，因該病菌可能導致腸道病毒的傳播，如傷寒、霍亂和傳染性肝炎等，是醫療機構污染物排放情況的重要監測指標，廣泛應用于水體衛生質量的評價。

目前國內外有多管發酵法、濾膜法、紙片法、酶底物法等多種方法檢測水中的糞大腸菌群，這些方法各有優劣勢，適用范圍也有所區別。其中多管發酵法和酶底物法在結果表示上均使用一種基于泊松分布的間接計數MPN法，簡單地說就是利用細菌在水體中是隨機分布的特性，根據統計學概率理論，通過查表估算一定體積水樣中目標微生物的濃度。這兩種方法檢測原理不同，多管發酵法從活性細菌的生化反應進行判斷，而酶底物法根據酶原反應進行判斷。由于在《水質 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》(HJ 1001—2018)中的適用范圍未明確酶底物法可用于檢測醫療機構廢水，環境檢測機構在開展此類檢測工作中，普遍采用《醫療機構水污染物排放標準》(GB 18466—2005)中的附錄A多管發酵法或者與附錄A方法原理相同的可適用于醫療機構廢水監測的《水質 糞大腸菌群的測定 多管發酵法》(HJ 347.2—2018)[3]。但是多管發酵法檢測周期長，操作步驟繁瑣，需要確認實驗。相對而言，酶底物法可使用成品培養基，操作簡單、耗時短、結果可靠，可以很大程度省去前期培養基準備和玻璃儀器清洗的人力和時間，實驗廢物易集中滅菌處理，被世界各國和各組織機構廣泛應用于水質檢測[4]。

本文應用多管發酵法和酶底物法同時檢測醫療機構廢水中糞大腸菌群，通過分析所得的試驗統計數據，開展技術等效性驗證，討論酶底物法的適用性。

1 實驗部分

比對試驗中用到的培養基、試劑、儀器設備和方法等分別按照《水質 糞大腸菌群的測定 多管發酵法》(HJ 347.2—2018)15管法和《水質 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》(HJ 1001—2018)準備和測定。

1.1 主要材料與設備

儀器和設備參數見表1、表2。

表1 實驗儀器情況

表2 實驗設備情況

1.2 水樣來源

為確保水樣具有代表性，本次醫療機構廢水選取自轄區內兩家床位數1000張以上的大型三甲醫院、兩家床位數約150張的二乙醫院，以及兩家床位數約30張的專科醫院。因疫情期間，醫療機構均加大消毒力度，總排放口出水的糞大腸菌群數普遍偏低，為保證數據具有統計意義，水樣應有足夠的陽性檢出率，部分水樣為消毒工序前后以適當比例混合的廢水，共采集廢水樣36份。

1.3 實驗與數據分析

1.3.1 試驗一

方法的技術等效性主要是通過兩種方法檢測同一樣品，分析檢測結果的精密度和正確度是否存在顯著性差異[5]。因此本試驗設計對其中1份醫療廢水樣采用多管發酵法15管法和酶底物法分別在重復性條件下進行6次檢測，測定結果見表3。

表3 多管發酵法與酶底物法重復性測定結果

表4 F檢驗結果

采用t檢驗法比較這兩組數據平均值的一致性，由表5得到t統計值

表5 t檢驗結果

1.3.2 試驗二

對36份醫療機構廢水分別嚴格按照多管發酵法15管法和酶底物法開展試驗分析，檢測水中的糞大腸菌群，測定結果見圖1，線性回歸情況見圖2。由圖2可得，兩種方法檢測結果的相關系數r=0.984，表明多管發酵法結果和酶底物法結果呈顯著的正向影響關系，兩組數據有較好的趨勢性。

圖1 多管發酵法與酶底物法檢測結果

圖2 多管發酵法與酶底物法線性回歸分析

運用SPSS統計工具對多管發酵法與酶底物法檢測糞大腸菌群的結果分別進行線性回歸分析和配對t檢驗分析，由表6可知，標準化回歸系數β值為0.984，非標準化回歸系數B達到0.986，回歸系數t檢驗為31.915，將多管發酵法作為自變量，意味著多管發酵法可以解釋酶底物法的96.8%變化原因。表7配對t結果表明，多管發酵法與酶底物法檢測結果的P值為0.103，大于0.05，兩種方法的檢測結果無顯著性差異[6]，可以認為兩種方法在檢測醫療廢水中的糞大腸菌群技術上是等效的。

表6 多管發酵法與酶底物法檢測結果的線性回歸分析

表7 多管發酵法與酶底物法的配對t檢驗結果

2 討論

為減少試驗誤差，需做好以下質量控制工作:①本試驗檢測對象糞大腸菌群是微生物活體，其增長繁殖是以幾何級數量遞增的，因此多管發酵法與酶底物法的比對試驗應同時開展；②在制作試管培養基過程中，經常會出現小導管中有氣泡的問題，影響結果判讀，可使用透氣性好的棉花塞，切勿使用橡皮塞。高溫蒸汽滅菌鍋應自然冷卻至內外壓力和溫度平衡時再打開鍋蓋；③水樣分析前，應調節樣品的pH值，并確認培養基和無菌水的pH值，避免多管發酵法試驗結果出現假陽性或者假陰性的情況；④多管發酵法復發酵試驗時，應在轉接培養物后30min內放進提前預熱的恒溫培養箱，否則非目標菌的生長繁殖可能導致假陽性，影響試驗結果；⑤微生物在環境水體中的分布是不均勻的，在分樣前應確保水樣混合均勻，使用渦旋振蕩器可以達到混勻效果，同時避免手搖混勻導致的樣品或環境污染；⑥溫度對微生物的生長繁殖影響很大，在培養過程中可使用在線溫度監控設備監控培養箱的運行狀況，確保溫度波動在合理的區間范圍。

3 結論

通過以上兩組試驗證明，多管發酵法和酶底物法的檢測結果無統計學意義上的差異，兩種檢測方法是等效的，酶底物法可以用于醫療廢水中的糞大腸菌群的檢測。由于酶底物法操作簡便、反應專業性強、假陽性率低，能夠用于大批量水質檢測工作，快速評價各類水體受污染的狀況，同時減少環境污染和人員感染的風險，對預報、預防和控制流行疾病傳播具有重要的現實意義。