基于高通量RNA-Seq技術探討補陽還五湯治療小鼠腦梗死的作用機制

劉亞杰，李玉娣，黎凱鋒，陳哲鋒，凌莉

卒中是世界范圍內致死率和致殘率最高的疾病之一，腦梗死占卒中的60%～80%，給社會和家庭帶來沉重負擔。因此，迫切需要研究減輕腦梗死后組織損傷、促進神經功能恢復的藥物。腦梗死的病理損傷機制非常復雜，涉及興奮性氨基酸毒性、氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡等多個方面，這可能是針對單一靶點的藥物臨床療效欠佳的原因。近年來的研究表明，中藥復方可能作用于腦梗死后病理損傷的多個分子靶點和信號通路，在腦梗死的治療方面具有獨特優勢[1-3]。補陽還五湯是清代名醫王清任所創的經典名方，數百年來在治療急性卒中及其后遺癥方面具有較好的臨床療效。現代研究表明，補陽還五湯對腦梗死動物模型有明確的神經保護作用[4-5]。但其作用的分子機制尚不完全清楚。本研究采用高通量RNA-Seq技術分析補陽還五湯對急性腦梗死小鼠缺血腦組織基因表達的影響，從多個分子靶點的角度闡明補陽還五湯治療小鼠腦梗死的分子機制，為補陽還五湯治療腦梗死提供新的思路與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物 補陽還五湯由生黃芪120 g、當歸尾6 g、赤芍5 g、川芎3 g、地龍（去土）3 g、桃仁3 g、紅花3 g組成。本研究中所有中藥飲品均由深圳市中醫院藥房提供。水煎濃縮成含生藥1.859 g/mL，于4 ℃冰箱保存。根據人與小鼠等效換算，按18.59 g/kg小鼠體重生藥量每天予小鼠灌胃。

1.2 實驗動物、腦梗死模型制作和實驗分組共購買30只10周雄性C57BL/6J小鼠（體重20±3 g，來自廣東省實驗動物中心）。飼養于溫度20～23 ℃，相對濕度40%～60%的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級動物房，自由進食與進水。本實驗已通過南方醫科大學深圳醫院動物倫理委員會批準（動物倫理批號：2022-001）。

參照本課題組前期方法制作左側永久性大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的小鼠腦梗死模型12只[6]：先予3%水合氯醛腹腔麻醉，在手術顯微鏡下于左眼裂外側與左耳根連線中點切開皮膚，分離肌肉，在左側顴弓根前方顳骨上鉆開一個直徑為1 mm的骨窗，暴露左側大腦中動脈，在大腦中動脈跨越嗅束的遠端采用雙極電凝器將其凝閉，然后結扎雙側頸總動脈7 min，逐層縫合切口并常規消毒。術后采用電熱毯使小鼠體溫保持在37±0.5 ℃。小鼠麻醉清醒后置于SPF級動物房飼養。

將腦梗死小鼠隨機分為治療組和模型組（每組6只小鼠），分別從MCAO術后1 d起每天灌胃生藥量為18.59 g/kg的補陽還五湯或等容積蒸餾水，每天分兩次灌胃，連續7 d。假手術組小鼠（6只）僅于同一部位開顱并暴露左側大腦中動脈，但不作電凝，完畢縫合術口。

1.3 神經功能評分 于治療前和MCAO術后第7天采用改良神經損傷嚴重程度評分（modified neurological severity scores，mNSS）對各組小鼠的神經功能進行評估[包括行為測試（偏癱及自由行走）、平衡木測試和反射缺失][7]，評分越高提示神經功能缺損越嚴重。

1.4 小鼠腦組織RNA提取和cDNA文庫制備MCAO術后第7天，將治療組和模型組小鼠麻醉后取腦梗死灶周組織，同時取假手術組小鼠相應部位腦組織，使用總RNA抽提試劑提取總RNA。經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。采用RNA逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄合成互補DNA（cDNA），對純化的雙鏈cDNA進行末端修復，通過PCR擴增和純化構建cDNA文庫，然后對文庫進行質檢。

1.5 轉錄組測序及數據分析 文庫構建并質檢合格后采用Illumina HiSeg 4000平臺進行高通量測序（每組3只）。測序得到的原始數據經過濾（去除帶接頭的和低質量的數據）得到高質量數據用于分析。本研究采用Hisat 2軟件進行基因組比對，采用HTSeq軟件對各樣品的基因表達水平進行分析，將組間差異基因表達的閾值設定為|log2（fold change）|≥0.58，且P＜0.05。

1.6 測序結果的驗證 為驗證高通量測序結果的可靠性，本研究采用簡單隨機法挑選6 個差異表達基因進行定量反轉錄PCR（quantitative reverse transcriptasemediated PCR，qRT-PCR）驗證（每組6只），引物由上海生因公司合成，使用β-肌動蛋白（β-actin）基因作為內部對照（引物序列見表1）。qRT-PCR方法按試劑盒說明書提供的方法進行，使用2-ΔΔCt法計算樣品之間基因的相對表達水平。

1.7 生物信息學分析 為了推測補陽還五湯治療腦梗死的作用機制，分別對模型組對比假手術組上調的基因和治療組對比模型組表達下調的基因、模型組對比假手術組下調的基因和治療組對比模型組表達上調的基因進行交集，得出補陽還五湯治療腦梗死后逆轉的差異表達基因，進一步對這部分基因進行生物信息學分析，包括基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。GO分析通過生物過程、細胞成分、分子功能3個方面來描述基因的功能；KEGG則通過對基因集合進行生物通路富集分析來預測生物學功能。

表1 驗證的差異表達基因和內參的引物序列

1.8 統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件對數據進行統計分析。不符合正態分布的計量資料以M（P25～P75）表示，比較采用Kruskal-WallisH檢驗，總體比較以P＜0.05表示差異有統計學意義，進一步兩兩比較選用α分割法，以P＜0.017表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 補陽還五湯對小鼠腦梗死神經功能評分的影響 治療前，與假手術組相比，模型組和治療組小鼠mNSS升高，治療組和模型組小鼠mNSS差異無統計學意義。MCAO術后7 d，治療組小鼠mNSS評分低于模型組，差異有統計學意義（表2）。

2.2 補陽還五湯治療小鼠腦梗死后逆轉的差異基因表達譜 本研究通過高通量RNA-Seq分析獲得治療組、模型組和假手術組小鼠腦組織樣品的差異基因的表達譜，各組間差異表達基因數如韋恩圖（圖1A）所示。模型組與假手術組相比，篩選得到1672個差異性表達的基因（1413個上調基因和259個下調基因）（圖1B）；治療組與模型組相比，篩選得到301個差異性表達的基因（110個上調基因和191個下調基因）（圖1C）。

各組間差異表達基因的交集分析結果顯示，模型組與假手術組相比上調且補陽還五湯治療后下調的差異基因有134個，而模型組與假手術組相比下調且補陽還五湯治療后上調的差異基因有19個。補陽還五湯逆轉腦梗死后的差異基因的層次聚類分析結果見圖2。

2.3 補陽還五湯治療小鼠腦梗死后逆轉的差異基因的驗證 qRT-PCR驗證結果顯示，模型組小鼠腦梗死灶周Myd88、Map3k8、Lamc2、Il1r1、Tlr9基因的mRNA表達水平較假手術組明顯升高，而補陽還五湯治療后下降；模型組小鼠缺血腦組織中Cxcl10基因的mRNA表達水平較假手術組明顯下調，而補陽還五湯治療后明顯上調（圖3）。本研究qRT-PCR驗證結果與RNA-Seq結果完全一致，證實本研究的高通量測序結果是準確和可靠的。

2.4 補陽還五湯治療腦梗死小鼠后逆轉的差異基因的GO分析 交集部分的差異基因的GO分析結果顯示，腦梗死后顯著上調且補陽還五湯治療后顯著下調的134個基因顯著富集到508條GO條目，其中生物過程421條，細胞成分23條，分子功能64條。差異基因主要富集的前10個生物過程包括與炎癥反應、免疫反應及細胞死亡密切相關的“對干擾素β反應、炎癥反應的調節、T細胞介導的免疫調節、細胞殺傷、細胞因子介導的信號通路、中性粒細胞遷移、急性炎癥反應、Myd88依賴性Toll樣受體信號通路、參與細胞發育的程序性細胞死亡及自噬”；主要富集的前10個細胞成分包括主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類蛋白復合物、高爾基內側池、內質網出口部位、吞噬囊泡、內吞囊泡、內質網膜的組成部分、溶酶體、細胞器膜的組成部分、基底膜及細胞器膜固有成分；主要富集的前10個分子功能條目包括CD8受體結合、β2-微球蛋白結合、Toll樣受體結合、肽抗原結合、T細胞受體結合、免疫受體活性、堿性氨基酸跨膜轉運蛋白活性、IL-1受體結合、細胞因子結合及生長因子受體結合（圖4A）。

表2 治療前和MCAO術后7 d三組小鼠神經功能評分比較

圖1 治療組、模型組和假手術組小鼠腦組織的差異表達基因

圖2 治療組、模型組和假手術組小鼠腦組織差異表達基因聚類圖

腦梗死后顯著下調且補陽還五湯治療后顯著上調的19個基因顯著富集到202條GO條目，其中生物過程132條，細胞成分37條，分子功能33條。差異基因主要富集的前10個生物過程包括與神經可塑性有密切關系的“突觸小泡中的神經遞質負荷、錐體神經元分化、突觸可塑性的正向調節、突觸囊泡循環、神經遞質運輸、軸突引導、神經元投射引導、小泡介導的突觸轉運、細胞連接維持及神經元遷移的調節”；主要富集的前10個細胞成分包括興奮性突觸、突觸前膜的組成部分、過氧物酶體、層粘連蛋白復合體、突觸前膜、突觸小泡、胞外囊泡、細胞投射膜、神經元胞體膜及運輸囊泡；主要富集的前10個分子功能涉及神經肽Y受體活性、腺苷酸環化酶活性、L-谷氨酸跨膜轉運蛋白活性、神經遞質跨膜轉運蛋白活性、蛋白磷酸酶2A結合、連接酶活性、血清素受體活性、陰離子跨膜轉運活性、鈉離子通道的活動及熱激蛋白（heat shock protein，HSP）70結合（圖4B）。

2.5 補陽還五湯治療腦梗死小鼠后逆轉的差異基因的KEGG分析 交集部分的差異基因的KEGG富集通路分析結果顯示，腦梗死后上調且補陽還五湯治療后下調的基因主要富集到抗原處理和呈遞、Toll樣受體信號通路、噬菌體、IL-17信號通路、補體和凝血級聯、細胞衰老、細胞因子-細胞因子受體相互作用、NF-κB信號通路、NOD樣受體信號通路和趨化因子信號通路等（圖5A）；腦梗死后顯著下調且補陽還五湯治療后顯著上調的基因主要富集到萜類主鏈生物合成、糖胺聚糖生物合成硫酸肝素/肝素、醛固酮調節鈉重吸收、味覺傳導、谷氨酸能突觸、脂肪細胞脂肪分解的調節、長壽調節途徑-多物種、長時程增強、逆行內源性大麻素信號轉導和鈣信號轉導等信號通路（圖5B）。

圖3 補陽還五湯治療腦梗死小鼠后逆轉的差異表達基因的定量反轉錄PCR驗證

圖4 補陽還五湯治療腦梗死小鼠后逆轉的差異基因GO分析

圖5 補陽還五湯治療腦梗死小鼠后逆轉的差異基因KEGG通路分析

3 討論

補陽還五湯是治療缺血性卒中氣虛血瘀癥的中藥名方。研究證實，補陽還五湯治療腦梗死患者效果好[8-9]，但其神經保護機制尚不完全清楚。

本研究采用高通量RNA-Seq技術發現，假手術組、模型組和治療組小鼠腦組織的基因表達譜存在顯著差異，qRT-PCR驗證結果與RNA-Seq結果一致，炎癥反應是急性腦缺血后組織損傷的重要機制之一。有研究表明，促炎細胞因子Myd88、Map3k8、IL1r1、Tlr9等在腦缺血后表達上調，介導炎癥反應導致神經元死亡[10-14]。本研究結果顯示，補陽還五湯降低了小鼠腦梗死灶周Myd88、Map3k8、IL1r1、Tlr9基因的mRNA表達水平，表明補陽還五湯可作用于多個分子靶點來減輕腦梗死后的神經炎癥，這可能是其發揮神經保護作用的重要機制。

本研究進行了生物信息學分析，GO分析顯示，小鼠腦梗死后顯著上調且補陽還五湯治療后下調的差異基因有134個，GO分析顯示這些差異表達基因主要富集到急性炎癥反應、免疫調節、細胞死亡等生物學過程，這些均為腦梗死后組織損傷的主要病理機制。KEGG分析表明，IL-17信號通路、Nod樣受體信號通路、NF-κB信號通路等為差異表達基因主要富集的信號通路。文獻報道，腦缺血可誘發IL-17表達上調，激活Nod樣受體及NF-κB等炎癥信號通路，促進炎癥反應，導致神經細胞死亡[15-17]。由此，推測IL-17信號通路、Nod樣受體信號通路及NF-κB信號通路等可能是補陽還五湯減輕小鼠腦梗死后腦組織損傷的潛在信號通路。

對小鼠腦梗死后下調且補陽還五湯治療后上調的差異基因的GO分析顯示，這些差異基因主要富集到錐體神經元分化、突觸可塑性、神經遞質運輸等生物過程；與神經元、細胞投射膜及突觸等細胞組分密切相關；參與神經肽Y受體的活性蛋白質、谷氨酸跨膜轉運蛋白活性及神經遞質轉運活性等分子功能，這些生物功能對于腦梗死后神經結構修復和功能重塑是必不可少的。KEGG分析顯示，補陽還五湯治療后顯著上調的基因顯著富集到逆行內源性大麻素信號轉導、長壽調節通路及長時程增強等信號通路。這些通路不僅參與腦損傷后神經可塑性的調節，而且對缺血腦組織具有抗炎和神經保護作用[18-19]。本研究結果提示，補陽還五湯治療可能通過上調與神經重塑相關基因的表達水平，促進小鼠腦梗死后神經修復。

本研究表明，補陽還五湯可作用于與炎癥反應和神經可塑性密切相關的多個分子靶點，減輕炎癥導致的腦組織損傷并促進神經重塑，從而加快受損神經功能的修復。本研究為探討補陽還五湯治療急性腦梗死的作用機制提供了新的思路，不足之處是樣本量不夠大，同時通過生物信息分析得出的信號通路比較多，沒有進一步研究補陽還五湯糾正炎癥及促進神經重塑相關信號通路涉及的上游或下游相關受體及蛋白。