糖皮質激素對阿霉素腎病大鼠齦溝液中IL-6及TNF-α的影響

郭樂樂 侯月潔 徐文靖

天津市兒童醫院 300000

腎病綜合征 (Nephritic syndrome, NS)是一種常見的免疫炎癥性疾病，以大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫和高脂血癥為特征的臨床綜合征，在兒童和成人腎小球類疾病中發病率分別為70%～90%和21%～31%[1]。臨床治療通常以糖皮質激素(GC)為首選藥物[2]，因治療需要應用激素量大、時間長, 易出現較多不良反應和并發癥，如滿月臉、高血壓、糖尿病、骨質疏松等[3]。對口腔的副作用也逐漸受到關注：吸入治療時可引發口腔白色念珠菌感染；正畸過程中糖皮質激素可影響牙齒移動的效率或矯治完成后的穩定性；通過影響骨的愈合和重建，引發骨質疏松，從而影響種植體的骨結合等[4-6]。另外有學者[7]發現口服皮質激素藥物治療的腎病患者牙周健康情況變差，提示牙周炎與腎病及糖皮質激素的應用之間可能存在關聯。同時，糖皮質激素治療腎臟疾病時患者體內IL-6及TNF-α含量增高，IL-6、TNF-α作為牙周炎時機體免疫應答產生的細胞因子，與牙周炎的發生密切相關[8]。牙周健康是口腔臨床工作中的修復、正畸、種植等治療的基礎，本研究在腎病大鼠模型的基礎上進行激素治療，以IL-6及TNF-α水平為評價標準，旨在探討牙周炎與腎病及糖皮質激素應用之間的相關性，為腎病患者的口腔治療提供實驗指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器:鹽酸阿霉素(北京艾德萊生物科技有限公司)，注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(海正輝瑞制藥有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(北京雷根生物技術有限公司)，大鼠IL-6及TNF-α ELISA試劑盒(美國eBioscience公司)。

1.1.2 實驗動物分組及處理:60只SPF級健康、雄性WISTAR大鼠，體質量200～230g，飼養于中國醫學科學院放射研究所動物實驗室。適應性喂養1周，收集24h尿檢測尿蛋白呈陰性后，隨機分為兩組：正常組、腎病組，每組30只。腎病組采用間隔1周2次尾靜脈注射4mg/kg鹽酸阿霉素，建立大鼠阿霉素腎病模型，正常組尾靜脈注射等量生理鹽水。注射完成4周后將造模大鼠共30只置于代謝籠內收集24h尿液，用BCA蛋白定量試劑盒檢測尿蛋白；隨后將兩組大鼠各隨機抽取10只處死，摘取腎臟制作病理切片。尿蛋白定量>100mg/24h，結合大鼠腎臟組織病理表現證明大鼠腎病綜合征模型建立成功。剩余40只大鼠，隨機將正常組20只分為空白對照組、糖皮質激素組，每組10只；腎病組20只分為阿霉素腎病組、阿霉素腎病+激素灌胃組，每組10只。糖皮質激素組及阿霉素腎病+激素灌胃組建模后給予甲潑尼龍30mg/(kg·d)灌胃，連續10周，1次/d，空白對照組及阿霉素腎病組給予等體積生理鹽水灌胃。本研究中涉及內容均符合國家倫理原則，經醫學倫理委員會批準實施。

1.2 樣本采集

1.2.1 腎臟組織樣本：阿霉素注射完成4周后，正常組及腎病組各隨機抽取10只大鼠麻醉，摘取左側腎臟組織，固定于10%甲醛中，用于制作病理切片。

1.2.2 齦溝液樣本：各組灌胃10周后進行齦溝液樣本采集，稱取大鼠體質量按3ml/kg注射10%水合氯醛溶液，待大鼠麻醉后取其仰臥位，固定口腔，將大鼠右下頜第一磨牙頰面用無菌棉球擦拭，隔濕,干燥，將兩根40號標準化滅菌紙尖分別插入隔濕的大鼠右下頜第一磨牙的(M1)近遠中位點的牙周袋內，直至遇輕微阻力為止，靜置15s后取出,合并置于含有1ml無菌PBS的EP管中(若紙尖上有血則棄之重取),-20℃凍存備用。

1.2.3 牙周組織樣本：齦溝液樣本采集完成后將大鼠處死，切取右側上頜骨，保留磨牙及周圍牙槽骨，置于10%甲醛溶液中固定，用于組織切片制作。

1.3 實驗方法

1.3.1 24h尿蛋白定量：采用BCA蛋白定量試劑盒檢測。

1.3.2 組織切片制作：將上頜骨標本置于10%甲醛溶液中，4℃固定1周，8%的甲酸溶液脫鈣1周，60%、70%的酒精脫水各1h，80%的酒精脫水過夜，90%、95%、100%的酒精脫水各1h，65℃環境下浸蠟2次，各1.5h，石蠟包埋，在切片機上沿牙體長軸近遠中向制作厚度為6μm的組織切片，HE染色。腎臟病理切片制作除去脫鈣其余步驟同牙周切片制作相同。

1.3.3 齦溝液IL-6及TNF-α檢測：由eBioscience公司提供的試劑盒，采用ELISA雙抗體夾心法分別測定齦溝液中IL-6及TNF-α。嚴格按說明書操作，室溫下將樣本融化，加入蒸餾水重建大鼠IL-6標準品，每個反應孔各加入標準品或待測樣品100μl，加入50μl生物素共軛物。室溫下孵育2h，洗板。向所有微量孔內加入100μl抗生蛋白鏈菌素-HRP，室溫下孵育2h，洗板。向所有微量孔內加入100μl TMB底物溶液，室溫下孵育10min。每個微量孔快速加入100μl終止液，終止酶反應，使用分光光度計以基色波長450nm檢測各個微量孔吸光度。采用TECAN sunrise 酶標儀，測得各檢測孔吸光度值，按點到點繪制標準曲線，根據樣本孔吸光度值求得樣本濃度。TNF-α檢測步驟同IL-6。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察 空白對照組大鼠體重持續增長，皮毛光潔，飲食、尿量無明顯改變。腎病組大鼠不同程度出現體重增長較對照組緩慢或下降情況，皮毛蓬松無光澤或有臟污，精神不活躍，其中以阿霉素腎病+激素灌胃組最為明顯。

2.2 腎臟組織學觀察 光鏡觀察：空白對照組無異常(圖1a)，腎病組可發現腎小管內有較多蛋白管型，部分的腎小球系膜細胞呈輕度增生(圖1b)，腎小球可見節段性硬化，囊壁可見增厚(圖1c)。腎病組的病理表現與人類慢性腎小球腎炎和局灶節段性腎小球硬化類似，是不同腎病終末期的共同形態學表現，證明本實驗所造模型為慢性腎病綜合征模型，符合本實驗要求。

2.3 牙周組織學觀察 空白對照組結合上皮位于釉牙骨質界，牙齦牙周膜纖維排列整齊，無炎癥反應，牙槽嵴頂無吸收(圖2a)；糖皮質激素組溝內上皮和固有層可見炎細胞浸潤，牙周纖維排列紊亂，毛細血管數目增多，擴張充血(圖2b)；阿霉素腎病組牙周組織有少量炎癥細胞浸潤，牙周纖維排列稍有紊亂(圖2c)；阿霉素腎病+激素灌胃組牙周纖維排列紊亂，牙槽嵴頂可見破骨細胞(圖2d)。

a b c

a b

2.4 大鼠齦溝液IL-6及TNF-α水平 與空白對照組相比，其他三組大鼠齦溝液中IL-6及TNF-α含量均升高(P<0.05)，其中阿霉素腎病+激素灌胃組的IL-6、TNF-α明顯高于其余三組(P<0.01)，糖皮質激素組與阿霉素腎病組的IL-6、TNF-α無統計學差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠齦溝液的IL-6及TNF-α含量比較

3 討論

牙周病發病機制復雜，可從自身免疫反應、環境因素和系統性疾病影響等方面得以解釋。越來越多的流行病學調查研究證明牙周炎與慢性腎病具有相關性，一項研究中，美國牙科協會列出與口腔健康相關的系統性疾病，其中便包括腎臟疾病[9]。目前，關于兩種疾病相互影響的機制一些學者提出，牙周致炎因子在患者體內的循環水平提高，增加了系統性炎癥的負擔，體內IL-6含量增加，與腎小球系膜細胞表面IL-6受體結合刺激系膜細胞增殖，從而使腎小球病理變化加劇，引起腎小球組織結構及功能的異常，可能會導致腎病患者病情的惡化[10]。而包括TNF-α在內的腫瘤壞死因子可引起腎臟固有細胞增殖，刺激其表達黏附分子和其他炎癥介質導致腎臟系膜細胞的損傷進而促使腎病的惡化。慢性腎病患者針對包括IL-6和TNF-α在內的致炎因子表現出活躍的系統性炎癥反應，體內IL-6、TNF-α含量增加，并且經過牙周基礎治療后，炎癥因子的水平明顯下降[11]，表明牙周炎與慢性腎病有一定的相關性。

IL-6作為炎性因子的一種與牙周炎有密切的關系：針對炎癥刺激誘導一系列反應，并且控制其他細胞因子的表達，如IL-1、IL-10、TNF-α等；通過影響齦下菌群的組成、增加牙周致病菌定植的敏感性在革蘭陽性菌引起的炎癥反應中發揮重要作用[12]；促進牙槽骨的吸收，誘導破骨細胞前體轉化為成熟的破骨細胞促進骨基質的降解。此外，IL-6具有抑制牙槽骨吸收后新骨的形成；Moreira等[13]發現，IL-6的表達量與牙周附著喪失有密切關系。以上均證明IL-6參與牙周炎的發病機制。TNF-α是由單核巨噬細胞產生的一種低分子量蛋白質，通過誘導成骨細胞、牙周初代細胞、T細胞和牙周膜細胞，增強人破骨細胞活性進而促進牙槽骨吸收，增加基質金屬蛋白酶的產生，導致膠原纖維的破壞，刺激基質細胞的凋亡，限制牙周組織的修復等。TNF-α的濃度與牙周炎的病程密切相關，在牙周病發展過程中加重炎性反應，促進牙槽骨破壞[14]。

實驗結果中發現腎病綜合征大鼠齦溝液中的IL-6及TNF-α含量高于空白對照組大鼠(P<0.05)，與國外研究報道相符[15]。表明腎病綜合征可造成牙周致炎因子的升高，可能會引發或加重牙周炎，造成牙周病的潛在威脅，并且牙周組織切片中腎病綜合征組有輕微的炎癥表現，共同證明腎病綜合征可造成牙周的炎癥。有研究發現由腎病引發的炎癥反應可對牙周組織產生危害，加重牙周疾病的程度，引起牙槽骨、牙齦、牙周膜和牙骨質等牙周組織的病理性改變[16]。臨床觀察得知大約90%的慢性腎病患者出現牙周異常的癥狀，較正常人群牙周狀況差，并且經過牙周非手術治療后，牙周情況普遍好轉。我國傳統中醫認為齒為腎之標，腎氣盛則齒更發長，牙齒浮動多為腎氣虛衰、牙齒失榮導致，腎臟疾病是牙周炎發病的主要因素，并且通過補腎藥物配合牙周基礎治療對牙周炎的療效顯著[17]，更加驗證本實驗結論。

近年來，內分泌與牙周炎的相關性受到人們的關注，從而提示糖皮質激素與牙周炎之間有一定的聯系[18]。本文結果顯示，糖皮質激素組大鼠齦溝液中的IL-6及TNF-α含量高于空白對照組大鼠(P<0.05)，且與阿霉素腎病組的IL-6、TNF-α含量無統計學差異(P>0.05)，同時糖皮質激素組牙周組織病理切片中表現出輕度炎癥，表明糖皮質激素的應用可能會引起牙周炎癥。而李生嬌等[19]通過制造牙周炎大鼠模型并給予激素皮下注射發現單純的糖皮質激素失調并不能引起牙周炎的發生，但卻可以加重牙周炎的嚴重程度，該學者觀點與本實驗略有差異，推測可能是由于激素灌胃時間短及劑量不同所導致，該差異造成的原因還有待進一步實驗研究。

本文結果顯示，阿霉素腎病+激素灌胃組大鼠齦溝液中IL-6及TNF-α的含量高于阿霉素腎病組(P<0.05)，并且阿霉素腎病+激素灌胃組的組織切片中炎癥反應較阿霉素腎病組更嚴重，且出現破骨細胞。表明在腎病綜合征的基礎上糖皮質激素治療可引起大鼠齦溝液中的致炎因子含量的升高，加重牙周組織的炎癥反應，與之前的研究結果較為一致。

綜上所述，阿霉素腎病大鼠本身存在牙周異常，腎病與牙周病之間存在一定的相關性，在腎病基礎上使用大劑量糖皮質激素治療后會使大鼠牙周異常加重。本實驗結論為進一步研究牙周炎與腎病及糖皮質激素應用之間的關系提供了理論和實驗基礎，并且對臨床腎病綜合征患者的激素治療方案和牙周炎的預防、治療具有一定的指導意義。但本實驗研究樣本小，檢測指標較少，結論有一定的局限性，仍需進一步的實驗研究和臨床驗證。