外周血miR-197聯合胃蛋白酶原在胃早癌診斷中的價值研究*

譚志慧 李芳芳 郭旺源 李愛娟

湖南省郴州市第一人民醫院 423000

胃癌是全球第四大惡性腫瘤之一，其死亡率與發病率僅次于肺癌，位居第二[1-2]。研究表明，相對于中晚期胃癌，胃早癌患者若及時采取治療措施，其5年生存率可遠遠超過90%。但早期胃癌病情隱匿，因此多數患者確診時已處于中晚期，失去最佳治療時機。故早診斷、早治療是決定胃癌預后的關鍵。目前，胃鏡活檢雖然是胃癌診斷的金標準[3]，但是該方法具有患者耐受度低的局限性，無法成為胃早癌常規篩查方式。胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)以經濟、簡單、無創等優勢在胃早癌篩查中備受青睞[4-5]，20世紀90年代，日本便運用PG聯合幽門螺桿菌檢測確定胃早癌高危人群[6]。但胃癌的發生是多因素、多步驟、多基因參與的結果。如遺傳、幽門螺桿菌感染、吸煙、飲酒等均是胃癌發生的危險因素，而胃黏膜萎縮、腸化生等均被視為癌前病變階段。同時隨著分子信息學的進步，各國研究者均發現，miR可調控細胞分化、增殖、生長、遷徙、周期及凋亡，與腫瘤的發生存在密切關系。miR-197是miRNA家族中的一員。多項研究報道，肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤患者外周血miR-197水平均有所上升。但鮮少學者研究miR-197與早期胃癌之間的相關性。為提高早期胃癌實驗室診斷水平，本研究將PG與miR-197聯合進行檢測，研究結果如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧分析2019年1月—2021年4月在本院接受胃鏡篩查的500例疑似胃癌患者臨床資料。根據病理檢查結果將其中胃早癌患者分為研究組(254例)，另將其中萎縮性胃炎、腸化生等胃部疾病患者分為對照組(246例)。同時依據胃鏡及病理檢查結果將對照組患者分為萎縮性胃炎組(83例)、腸化生組(82例)、異型增生組(81例)。其中研究組男134例，女120例；年齡32～72歲，平均年齡(52.68±20.14)歲。對照組男125例，女121例；年齡32～73歲，平均(52.78±20.57)歲；病變類型：萎縮性胃炎(83例)、腸化生(82例)、異型增生(81例)。研究組與對照組性別、年齡等基本資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：①存在反酸、噯氣、腹部脹痛等上消化系統癥狀者。②同意接受胃鏡、組織穿刺活檢及血清檢查者。③年齡>18歲，且<80歲者。④血清PG、miR-197胃鏡及相關病理檢查資料齊全者。(2)排除標準：①曾經胃鏡檢及相關病理檢查證實，具有消化性潰瘍、消化道腫瘤、食管及十二指腸病變者。②近1個月之內使用質子泵抑制劑、鉍劑或抗生素者。③有消化道手術史者。④近2周之內，服用華法林、阿司匹林等抗凝藥物者。⑤具有胃鏡檢查禁忌者。⑥合并心腦血管、肝臟、腎臟等組織器官嚴重器質性病變的患者。⑦其他部位伴有惡性腫瘤的患者。

1.3 方法 血清PG檢測：全部患者均于胃鏡檢查前，空腹狀態下抽取外周靜脈血5ml,并將其保存于抗凝試管中。以3 000r/min的速度離心10min，取上清液待檢。運用酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)(試劑盒購自廣州市豐華生物工程有限公司)測定胃蛋白酶原Ⅰ(PepsinogenⅠ，PG)、胃蛋白酶原Ⅱ(Pepsinogen Ⅱ，PGⅡ)。外周miR-197檢測：(1)RNA提?。簩⒀鍢颖痉湃?℃離心機中以16 000g離心力離心10min，清除細胞碎片后，將樣本置于-80℃冰柜中待檢。將200μl血清放于37℃水溶鍋中，并加入1 000μl(5倍體積血清)的QIAzol試劑，將血清完全溶解。靜置5min后，加入3.5μl的外參物(秀麗隱桿線蟲miR-39)，同時加入200μl氯仿，震蕩15s后，靜置2～3min。用4℃的臺式離心機以12 000g離心力離心15min，用1.5ml的PE管收集上層透明液，并加入900μl(1.5倍體積)的無水乙醇。將混合液700μl加入miRNA提取試劑盒。再運用常溫臺式離心機以≥8 000g離心力離心15s，去除底層離心液體。將剩余液體再次放入miRNA提取試劑盒，以同樣方式離心，去除底層液體后，依次加入700μ lRWT試劑、500μl RPE試劑、500μl的80%乙醇并分別進行離心后，用2ml新的PE管收集旋轉柱，再次離心5min，并去除底層離心液體，最后用1.5ml新的PE再次收集旋轉柱，將14μl無酶水加入旋轉柱子正中心表面，全速離心1min后洗提RNA。并用上海美譜達MAPADA紫外分光光度儀測定RNA純度與濃度。(2)反轉錄—定量酶合反應：將賽默飛世爾科技中國生產的miRNA反轉錄試劑盒于冰上解凍。準備好反轉錄試劑及無RNA酶EP管，通過輕微離心或混勻使樣本沉于管低。將反轉錄條件依次設為37min、60min、95℃、5min、4℃、Forever。獲得反轉錄產物后，將其置于冰上，并同時制備PCR反應試劑。將PCR條件設置為，2μl的PCR產物、6μl的無酶水、95℃、34s、95℃、3s、60℃、30s、40個循環。反應結束后計算獲得miR-197相對表達。

1.4 觀察指標 比較研究組與對照組外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ水平；比較研究組、萎縮性胃炎組、腸化生組及異型增生組不同病理分型患者外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ水平。分析miR-197、PGⅠ、PGⅡ水平及聯合指標對胃早癌的診斷價值。

2 結果

2.1 研究組與對照組外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ水平比較 研究組miR-197顯著高于對照組(P<0.05),而PGⅠ及PGⅡ顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 研究組與對照組外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ水平比較

2.2 不同病理分組患者外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ水平比較 萎縮性胃炎組、腸化生組、異型增生組及研究組外周血miR-197、PGⅡ及PGⅠ比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)。經LSD-t事后多重比較顯示，不同病理分組組間外周血miR-197比較結果為:研究組>異型增生組>腸化生組>萎縮性胃炎組，差異均有統計學意義(P<0.05)，而不同病理分組外周血PGⅠ及PGⅡ組間比較結果為,萎縮性胃炎組>腸化生組>異型增生組>研究組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同病理分型患者外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ水平比較

2.3 外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ及聯合檢測因子對胃早癌的診斷價值 經ROC曲線分析得出，miR-197、PGⅠ、PGⅡ及聯合預測因子共4項對胃早癌有著較高的診斷價值，其中聯合檢測因子與PGⅠ對早期胃癌診斷效能高于miR-197及PGⅡ，且比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ及聯合預測因子對胃早癌的

表3 外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ及聯合檢測因子對胃早癌的診斷價值

3 討論

我國是胃癌高發大國，據統計，每年約35%的胃癌患者發生在中國，且隨著人們飲食結構與生活方式的轉變，胃癌的發病率及死亡率有逐漸攀高趨勢[7-8]。目前，胃癌以其高發病率及高死亡率成為威脅國民生命健康的難治疾病之一。其中局限于胃內壁黏膜及黏膜下層的癌變組織稱為胃早癌。相對于中晚期胃癌，通常胃早癌可通過胃鏡或內鏡下進行病灶切除，術后無須放化療，且預后良好。但早期胃癌癥狀隱匿，僅有小部分患者具有消化道規律性疼痛等不典表現。因此多數胃癌患者被確診時，已進入中晚期，無論采取手術、化療、放療等方式治療，預后效果均較差。故早診斷、早治療是影響胃癌預后的關鍵所在。目前，多采用胃鏡及組織穿刺活檢對胃癌進行診斷，其中組織穿刺活檢準確性極高，可視為胃癌診斷的金標準。但上述檢查方式存在一定創傷性，且患者耐受度及接受度均較低，因此無法作為胃早癌的常規篩查手段。因此臨床尋求經濟、安全、高效的方式對胃早癌進行診斷具有十分重要的意義。

PG是胃蛋白酶前體，可分為PGⅠ及PGⅡ兩種不同亞群[9]。其中PGⅠ主要由黏液頸細胞及胃底主細胞分泌，而PGⅡ不但能通過上述兩種細胞分泌，還可通過胃竇幽門腺、賁門腺及Brunner腺細胞分泌。因此血清PG的濃度可反映機體胃部的狀態[10]。本研究結果顯示，研究組外周血PGⅠ及PGⅡ水平顯著低于對照組，且外周血PGⅠ及PGⅡ水平隨萎縮性胃炎、腸化生、異型增生及胃早癌等胃部病變進展而降低。分析原因為：PG主要來源于胃黏膜組織，當胃黏膜發生病變后，胃部腺體亦會發生功能障礙，且隨著病情進展，萎縮加重、腸化生、異性增生及致癌因子出現，進一步破壞胃部腺體細胞，同時也可造成PG基因突變，失去分泌PG功能，故隨著病情進展，外周血PG水平均顯著下降。但因PGⅠ僅來源于黏液頸細胞及胃底主細胞，黏膜病變時主細胞減少，故PGⅠ下降更顯著，而PGⅡ來源范圍較廣泛，組織內濃度可保持相對穩定，因此PGⅡ下降幅度比較平緩。故臨床稱PGⅠ為胃早癌的“血清活檢”。本研究經ROC曲線分析得出，PGⅠ對胃早癌診斷效能更高，與上述結論基本一致。

雖然血清PG檢查在胃早癌的診斷中具有經濟、簡便、高效等特點，但胃癌是多種因素、多個步驟參與的結果。近年來，有研究發現基因網絡調控機制與胃癌癥的發生也存在密切關系。生物信息學分分析發現，miRNA是由22個核苷酸組成的內源性非編碼RNA，可通過參與細胞分化、增殖、代謝及凋亡等過程而參與多種腫瘤發生過程。其中miR-197是miRNA家族中的一員，多項研究證實其異常表達與乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤存在顯著關系。本研究結果表明，研究組miR-197顯著高于對照組，且隨著萎縮性胃炎、腸異生等病情進展，外周血miR-197顯著升高，同時ROC曲線分析得出miR-197對胃癌早癌具有較高診斷價值。分析原因如下，miRNA通過調節炎癥通路炎性因子水平而在胃癌的發生發展中發揮重要作用。而miR-19可能為IL-IF5基因中的rs2472188位點靶結合點，當miR-19與之結合后上調IL-IF5表達水平，而IL-IF5可調控IL-I家族、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、巨噬細胞遷徙抑制因子等多種與胃癌相關的炎性通路信號因子表達，在胃癌發生發展中發揮重要作用。故miR-19可間接通與IL-IF5基因結合，調控胃癌相關炎性因子表達而參與胃癌的發生，因此miR-19對早期胃癌具有一定診斷價值。

綜上所述：外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ對胃早癌均具有較高診斷價值，其中PGⅠ與聯合預測因子診斷效能更高。