五味子甲素對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠炎性腸病的保護(hù)作用

許 紅，李鑫磊，李若男，陳 喜，徐志立

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

炎性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一種主要累及消化系統(tǒng)的慢性炎癥性腸道疾病[1]。其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，通常認(rèn)為是由機(jī)體內(nèi)在原因(包括遺傳易感性、腸黏膜免疫異常和腸道微生態(tài)改變等)和外部因素(環(huán)境、飲食、生活方式變化等)共同作用所致[2]。IBD主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便，且反復(fù)發(fā)作，常給患者造成心理及生理上的巨大負(fù)擔(dān)。目前，IBD主要以水楊酸類、激素類、免疫抑制劑和生物制劑等藥物治療為主，但存在各種缺陷[3]。與西藥相比，傳統(tǒng)中藥價(jià)格低廉，副作用較小，為IBD的治療提供了新的治療思路。

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.或華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實(shí)。五味子甲素(Deoxyschizandrin)為五味子木脂素類的有效成分，有抑制腫瘤生長、抗炎、抗病毒的作用[4]。有研究表明，五味子甲素可通過調(diào)控炎性因子的水平，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)以及抑制TNF-α/NF-κB等多種炎癥相關(guān)信號(hào)通路的激活，有效緩解模型動(dòng)物的潰瘍性結(jié)腸炎[5-7]。本研究以3% DSS誘導(dǎo)小鼠IBD模型，探討預(yù)防性給藥條件下五味子甲素對(duì)于IBD小鼠的保護(hù)作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

五味子甲素(純度≥98%，批號(hào)：W-005-151221)購于南京道斯夫生物公司；柳氮磺吡啶腸溶片(SASP，批號(hào)：09200708)購于上海信誼天平公司；葡聚糖硫酸鈉(DSS，M/W50000)購于Sigma公司；RM2126石蠟切片機(jī)購于德國萊卡公司；顯微載玻片、組織包埋盒均購于江蘇世泰公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)購于湖南湘儀公司；DIV-86L386超低溫冰箱購于山東青島海爾公司；TP-114電子天平購于北京丹佛公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與模型制備 昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量26～33 g。隨機(jī)分為6組，每組10只。即正常組，模型組，五味子甲素高、中、低劑量組(80、40、20 mg/kg)，柳氮磺吡啶組。

1.2.2 給藥方法 除正常組飲用蒸餾水外，其余各組自由飲用3% DSS溶液連續(xù)16天，建立小鼠IBD模型。給藥組自造模起每日16∶00分別給予柳氮磺吡啶和不同濃度五味子甲素，給藥體積為0.2 mL/10 g。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 (1)小鼠一般生活習(xí)性及一般癥狀的觀察[8-10]。實(shí)驗(yàn)第0、1、4、8、12、16天觀察記錄小鼠毛發(fā)與精神狀態(tài)、行動(dòng)靈敏度、肛門便血情況及小鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)第16天按隱血試劑盒說明書檢測(cè)小鼠隱血程度并進(jìn)行隱血評(píng)分，計(jì)算小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)。DAI=(體質(zhì)量丟失率評(píng)分+糞便性狀評(píng)分+隱血程度評(píng)分)/3。體質(zhì)量丟失率評(píng)分：體質(zhì)量不變0分；體質(zhì)量丟失1%～5%，1分；體質(zhì)量丟失6%～10%，2分；體質(zhì)量丟失11%～20%，3分；體質(zhì)量丟失>20%，4分。糞便性狀評(píng)分：正常成型0分，松散樣糞便1分，半稀便樣糞便2分，稀便3分，水樣便4分。隱血程度評(píng)分：陰性0分，弱陽性1分，陽性2分，強(qiáng)陽性3分，肉眼可見便血(極強(qiáng)陽性)4分。

(2)小鼠結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間、結(jié)腸質(zhì)量及結(jié)腸指數(shù)的觀察。末次給藥2 h后，取直徑2 mm 的玻璃小球用靜脈輸液導(dǎo)管緩慢推入小鼠直腸3 cm處，將小鼠放回籠內(nèi)，籠底墊白色A4紙，啟動(dòng)計(jì)時(shí)器記錄小球排除時(shí)間。

取肛門至盲腸段小鼠結(jié)腸組織，稱重并計(jì)算結(jié)腸指數(shù)。結(jié)腸指數(shù)=結(jié)腸質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%。用預(yù)冷生理鹽水將腸腔沖洗干凈，置于4%多聚甲醛固定。

(3)HE染色法對(duì)小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的觀察。分離出的結(jié)腸組織使用4%多聚甲醛固定，流水沖洗后酒精梯度脫水，二甲苯透化。以二甲苯∶石蠟(1∶1)的混合液預(yù)處理后，將組織浸入石蠟包埋并切成4 μm的厚度，二甲苯脫蠟、梯度水化，蘇木素染色和伊紅染色，二度脫水加透化，中性樹膠封片，晾干后光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織形態(tài)和病理損傷情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[11]：炎性細(xì)胞浸潤程度：無炎細(xì)胞浸潤，0分；固有層炎細(xì)胞數(shù)量增加，1分；炎細(xì)胞浸潤至黏膜下層，2分；透壁性炎細(xì)胞浸潤，3分；組織損傷程度：無黏膜損傷，0分；散在上皮損傷，1分；局灶性潰瘍形成，2分；廣泛性潰瘍形成延伸至腸壁，3分。

2 結(jié)果

2.1 五味子甲素對(duì)DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠一般癥狀及體質(zhì)量的影響

如圖1所示，造模期間，正常組小鼠精神狀況良好，活潑好動(dòng)，毛皮柔順光澤，進(jìn)食及飲水正常，肛門處未見出血異常；模型組小鼠精神萎靡，飲食攝入量明顯減少，長時(shí)間靜止不動(dòng)，肛門處出現(xiàn)嚴(yán)重便血；給藥組小鼠，精神狀況一般良好，大便基本成型，肛門處紅腫有輕微便血出現(xiàn)。

注：A-F依次為正常組、模型組、五味子甲素高濃度組、五味子甲素中濃度組、五味子甲素低濃度組、柳氮磺吡啶組。

如圖2所示，禁食后實(shí)驗(yàn)開始，第1天，各組小鼠體質(zhì)量逐漸增加；實(shí)驗(yàn)第8天除正常組體質(zhì)量較快增長外，五味子甲素高濃度組和柳氮磺吡啶組增長速度變緩，五味子甲素中、低濃度組和模型組小鼠體質(zhì)量有下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)第16天，與正常組相比，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，五味子甲素高濃度組和柳氮吡啶組小鼠體質(zhì)量顯著升高并接近正常水平(P<0.01)；五味子甲素中、低濃度組體質(zhì)量略有降低，但跟模型組仍具有顯著性差異(P<0.01)。

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 五味子甲素對(duì)DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠隱血程度及疾病活動(dòng)指數(shù)的影響

如表1所示，與正常組相比，模型組小鼠隱血程度加重、DAI評(píng)分升高(P<0.01)。與模型組相比，給予40、80 mg/kg五味子甲素及柳氮磺吡啶后，小鼠隱血狀況緩解，DAI評(píng)分降低(P<0.05，P<0.01)。

表1 五味子甲素對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD模型結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間和DAI的影響

2.3 五味子甲素對(duì)DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間及結(jié)腸指數(shù)的影響

如表2所示，模型組小鼠結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸指數(shù)與正常組相比均顯著性增加，結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間顯著性縮短(P<0.01)。與模型組相比，80 mg/kg五味子甲素及柳氮磺吡啶可以使IBD小鼠結(jié)腸質(zhì)量減輕，結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間延長，結(jié)腸指數(shù)降低并趨向正常(P<0.05，P<0.01)；40 mg/kg五味子甲素可降低IBD小鼠結(jié)腸指數(shù)(P<0.05)。

表2 五味子甲素對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD模型結(jié)腸質(zhì)量的影響

2.4 五味子甲素對(duì)DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠結(jié)腸組織病理損傷的影響

HE染色結(jié)果如圖3、圖4所示。正常組小鼠腸黏膜完整，各層無水腫及炎細(xì)胞浸潤。模型組小鼠結(jié)腸有大量炎性細(xì)胞浸潤，腸黏膜可見潰瘍?cè)睿つぜ梆つは陆M織壞死，組織病理學(xué)評(píng)分顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，柳氮磺吡啶組80 mg/kg五味子甲素促使小鼠炎性細(xì)胞浸潤減少，潰瘍?cè)顪p少，黏膜水腫程度減輕，組織病理學(xué)評(píng)分降低(P<0.05，P<0.01)。

注：A-F依次為正常組、模型組、五味子甲素高濃度組、五味子甲素中濃度組、五味子甲素低濃度組、柳氮磺吡啶組。

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

目前，在炎性腸病臨床前研究中，多采用化學(xué)方法尤其是自由飲用DSS溶液誘導(dǎo)小鼠IBD模型[12]，其誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的機(jī)制可能與激活T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，造成細(xì)胞因子表達(dá)改變，從而使腸上皮細(xì)胞黏膜屏障被破壞有關(guān)[13]。該方法操作方便，成功率高，且與人患IBD的機(jī)制更為接近，因此本研究亦應(yīng)用3% DSS溶液誘導(dǎo)小鼠炎性腸病。

體質(zhì)量和DAI是反映IBD小鼠造模成功與否最直觀的指標(biāo)。IBD小鼠結(jié)腸黏膜屏障嚴(yán)重受損，體內(nèi)炎癥因子水平升高，嚴(yán)重影響腸道對(duì)食物的消化與吸收。在造模16天里，正常組小鼠體質(zhì)量逐漸升高；而模型組小鼠體質(zhì)量逐漸下降，隱血程度和DAI評(píng)分增加，表明IBD小鼠造模成功。有文獻(xiàn)報(bào)道表明[14]，IBD小鼠結(jié)腸動(dòng)力產(chǎn)生異常，結(jié)腸推進(jìn)性收縮波增多，使推進(jìn)速度加快。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間顯著短于正常組，而給予柳氮磺吡啶、五味子甲素后，小鼠結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間延長，說明五味子甲素可以一定程度上緩解IBD小鼠結(jié)腸腸動(dòng)力，改善其收縮功能。同時(shí)，模型組小鼠結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸指數(shù)升高，脾指數(shù)升高，肉眼及鏡下觀察結(jié)腸損害嚴(yán)重，給予柳氮磺吡啶和五味子甲素組小鼠可顯著緩解上述癥狀。綜上所述，五味子甲素預(yù)防給藥對(duì)于炎性腸病小鼠有明顯的保護(hù)作用。

雖然本研究從臨床癥狀、結(jié)腸指數(shù)、結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間、結(jié)腸組織病理損傷方面探討了五味子甲素對(duì)3% DSS誘導(dǎo)的小鼠炎性腸病的預(yù)防性作用，但仍需進(jìn)一步探討其具體作用機(jī)制。隨著對(duì)其作用機(jī)制、作用靶點(diǎn)的不斷深入研究，五味子甲素或?qū)⒊蔀橹委熝仔阅c病的有效藥物之一。