不同生境人參莖葉總皂苷對免疫抑制小鼠的作用比較

張靜雯，房慶偉，李 坤，葉 冠

(上海醫藥集團股份有限公司中央研究院，上海 201203)

藥用人參為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根和根莖，具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺等功效。人參的人工栽培品稱為園參，而在山林野生狀態下播種，不受人工干預、自然生長者稱為林下山參，俗稱“籽海”[1]。相較于人參根莖，人參莖葉資源豐富、價格低廉，其產量逐年增加，相關產品的開發研究也日益增多[2]。人參莖葉中含有豐富的皂苷類成分，其藥理活性強，具有抗腫瘤、抗衰老、促進細胞增殖、免疫調節等作用[3-4]。目前市場上流通的人參莖葉主要來源于園參，林下山參的莖葉未得到充分利用。然而，林下山參長于山野林間，生長年限長，所含人參皂苷的量與野山參較為相近且優于園參[5]。因此，林下山參莖葉潛在的藥用價值可能更勝于園參莖葉。為避免林下參莖葉資源的進一步浪費，對其進行深入開發利用具有重要意義。

目前林下參莖葉相關的藥效學研究較少，本研究主要從人參莖葉總皂苷的免疫調節活性入手，研究不同生境人參(園參、林下參)莖葉總皂苷對免疫抑制小鼠的免疫增強作用，并進行藥效比較，以期為人參莖葉的資源擴充與其藥用價值的充分開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 園參莖葉及林下參莖葉樣品，由葉冠教授級高級工程師鑒定為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥莖葉。園參莖葉總皂苷與林下參莖葉總皂苷均由實驗室提取分離而得，制法參考《中華人民共和國藥典》一部人參莖葉總皂苷項下提取方法[6]。經檢測，園參莖葉總皂苷中人參總皂苷含量為77.37%，人參皂苷Rg1、Re、Rd含量之和為34.06%，林下參莖葉總皂苷中人參總皂苷含量為77.07%，人參皂苷Rg1、Re、Rd含量之和為37.46%，二者均符合藥典標準。

1.1.2 實驗動物 SPF級ICR小鼠80只，體質量(20±2) g，雌雄各半，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(遼)2020-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2017-0040。

1.1.3 試劑 注射用環磷酰胺(CTX)(批號：H32020857)，購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；氯化鈉注射液(批號：A17111105)，購自河北天成藥業股份有限公司；小鼠免疫球蛋白G(IgG)(批號：MM-0057M1)、小鼠免疫球蛋白M(IgM)(批號：MM-0058M1)酶聯免疫分析試劑盒均購自江蘇酶免實業有限公司；PE anti-mouse CD3(批號：4AD122130F)、FITC anti-mouse CD4(批號：4AD122131F)、FITC anti-mouse CD8(批號：4AD122131F)，購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.1.4 儀器 BSA 224S電子天平(德國賽多利斯公司)；熱電MultiskanFC酶標儀、Attune NxT流式細胞儀(美國Thermo Scientific公司)；UV-5100紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；D3024R臺式高速冷凍離心機(美國Scilogex公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物造模及給藥 將ICR小鼠隨機分為8組(每組10只)：空白對照組(NC)，模型組(M)，園參莖葉總皂苷低(YSD)、中(YSZ)、高(YSG)劑量組(10、20、40 mg/kg)，林下參莖葉總皂苷低(LXD)、中(LXZ)、高(LXG)劑量組(10、20、40 mg/kg)。除空白對照組外，其余各組小鼠連續3 d皮下注射環磷酰胺60 mg/kg，造成小鼠免疫抑制模型。造模完成后，每天灌胃給藥1次，空白對照組和模型組給予等量生理鹽水，連續給藥14 d。

1.2.2 ELISA檢測血清IgG、IgM水平 各組小鼠摘眼球取血，血液樣本經3 000 r/min離心10 min后，分離血清，根據ELISA試劑盒說明書測定血清中IgG、IgM的含量。

1.2.3 流式細胞術檢測小鼠外周血中淋巴細胞及其亞群分布 各組小鼠眼眶取血，取全血50 μL，依次加入CD3+-PE、CD4+-FITC、CD8+-FITC單克隆抗體，置于流式細胞儀檢測并計數，計算CD3+細胞、CD3+CD4+細胞與CD3+CD8+細胞的含量。

2 結果

2.1 小鼠血清免疫球蛋白細胞水平測定結果

測定小鼠血清免疫球蛋白IgG、IgM水平，結果顯示，較空白對照組，模型組小鼠血清IgG、IgM水平均顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，園參莖葉總皂苷及林下參莖葉總皂苷各劑量組小鼠血清IgG、IgM水平均顯著升高(P<0.01)；與園參莖葉總皂苷組小鼠相比，林下參莖葉總皂苷組小鼠在給予相同劑量的條件下，其血清IgG、IgM水平更高(P<0.01)。結果見表1、圖1。

注：與模型組比較，**P<0.01；YSD、YSZ、YSG分別與LXD、LXZ、LXG比較，##P<0.01。

2.2 小鼠外周血淋巴細胞亞群檢測結果

流式細胞術檢測小鼠外周血淋巴細胞及其亞群分布，結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血液CD3+、CD3+CD4+細胞含量比例降低(P<0.05)，CD3+CD8+細胞含量比例升高(P<0.05)；與模型組比，園參莖葉總皂苷與林下參莖葉總皂苷各劑量組小鼠血液CD3+、CD3+CD4+細胞含量比例升高(P<0.05)，CD3+CD8+細胞含量比例降低(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴性。比較林下參莖葉總皂苷低、中、高劑量組與園參莖葉總皂苷對應低、中、高劑量組CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞含量比例，結果顯示低劑量組CD3+細胞含量比例有所差異(P<0.01)，高劑量組CD3+CD4+細胞含量比例差異較小(P<0.05)，其余劑量組CD3+細胞、CD3+CD4+細胞含量無明顯差異；園參莖葉總皂苷與林下參莖葉總皂苷對應各劑量組比較，CD3+CD8+細胞含量無明顯差異。結果見表2、圖2。

表2 園參莖葉皂苷與林下參莖葉皂苷對免疫抑制小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；YSD、YSZ、YSG分別與LXD、LXZ、LXG比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

目前，環磷酰胺、氫化可的松及地塞米松等藥物是誘導小鼠免疫抑制模型的主要造模劑，其中，關于環磷酰胺的應用最多[7]。環磷酰胺可通過抑制DNA合成，干擾核酸的復制與轉錄等途徑抑制免疫細胞的增殖，從而使免疫系統處于抑制狀態[8]。本研究采用環磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，研究林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷對免疫抑制小鼠的免疫調節作用。

體液免疫主要通過漿細胞釋放抗體來產生免疫應答，因此血清免疫球蛋白水平為體液免疫功能檢測的常用指標。IgG是機體再次免疫應答過程中產生的主要抗體，有抗菌、抗外毒素及抗病毒的活性；IgM是體液免疫中最早合成并分泌的抗體，能凝集細菌和病毒、中和毒素，在腫瘤免疫中起到重要作用[9]。本研究結果表明，林下參莖葉總皂苷組和園參莖葉總皂苷組小鼠血清IgG、IgM水平較模型組小鼠有所升高，表明二者均能改善小鼠的體液免疫功能。此外，在相同的給藥劑量條件下，林下參莖葉總皂苷具有更強的免疫增強效果。

T淋巴(CD3+)細胞可分為CD4+、CD8+兩個亞群。CD4+T淋巴細胞，又稱輔助性T淋巴細胞(help T cell，Th)，可分泌多種趨化因子及細胞因子，激活并募集靶細胞，在細胞免疫過程中發揮著關鍵作用[10]。CD8+T淋巴細胞，又稱細胞毒性T淋巴細胞，在清除體內的各種病原體和腫瘤細胞方面具有重要意義[11]。CD4+T細胞與CD8+T細胞的比例失調，說明T細胞免疫功能失常[12]。小鼠處于免疫抑制時，其外周血中CD3+細胞、CD4+T細胞含量下降，CD8+T細胞含量上升。本研究結果顯示，林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷均可增加免疫抑制小鼠外周血CD4+T細胞的數量，減少CD8+T細胞的數量，但組間差異不大，表明二者均能增強免疫低下小鼠的細胞免疫功能。

綜上所述，本研究結果說明了園參莖葉總皂苷和林下參莖葉總皂苷均能通過促進免疫低下小鼠的細胞免疫、體液免疫功能，來增強免疫抑制小鼠的免疫功能。在改善模型組小鼠體液免疫方面，林下參莖葉總皂苷的效果更好。本研究首次證實了林下參莖葉免疫增強的藥效作用，為人參莖葉藥用來源的擴充、林下參莖葉的現實應用提供了實驗依據。后續可深入研究林下參莖葉發揮免疫增強作用的機制。此外，不同生境的人參莖葉總皂苷種類、含量與藥效均不相同，因此二者間的藥效差異性成分仍需進一步探討。