丹參中33種農藥殘留的LC-MS/MS與GC-MS/MS檢測方法研究

李 剛，魏慶紅，懷 靜，孟 彪，段偉偉 ，劉愛珍

(1.中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室，安徽 亳州 236800；2.安徽協和成藥業飲片有限公司，安徽 亳州 236800；3.亳州市中藥材進出口檢測中心，安徽 亳州 236800)

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，功效為活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰，在醫藥界用處廣泛[1]。隨著2020版《中國藥典》的實施，四部通則2341要求藥材及飲片(植物類)33種禁用農藥不得檢出(不得過定量限)，但通則里并未指定每一品種藥材適用哪一種樣品前處理方法，需要每個單位根據藥材情況進行篩選，同時選擇對應品種的空白基質，保證加標回收率能滿足條件。然而在丹參33種農殘的檢測方法篩選過程中發現，2020版《中國藥典》規定的5種供試品溶液制備方式所得結果的線性關系及回收率均不能達到要求，結果詳見表1。丹參的主要化學成分包括脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的酚酸類化合物，而其中的菲醌類化合物容易引起有機磷類化合物的降解，從而導致目標物線性差、回收率低，如甲拌磷、涕滅威等甚至檢測不到峰[2-11]。本研究根據丹參樣品基質的特殊情況，在前處理過程中添加保護劑，降低其氧化能力[12-18]，在QuEChERS法基礎之上，建立了一種丹參的33種農藥殘留的快速檢測方法，該方法穩定性好，回收率均能滿足要求且重現性良好，靈敏度高。采用該方法共檢測了34批丹參樣品，結果均未檢測到2020版中國藥典四部通則2341涉及的33種農藥指標，初步表明中藥材丹參農藥殘留引起的風險性較小。

從上表結果可以看出，按照藥典四部通則2341規定的5種供試品溶液處理方式檢測丹參樣品，結果內吸磷、殺蟲脒、甲拌磷、苯線磷的線性及加標回收結果無法同時滿足要求。除上表之外，氯磺隆、蠅蟲磷、特丁硫磷、除草醚回收率低，無法滿足2020版中國藥典中規定回收率70%～120%的要求。為了能準確檢測丹參中33種農藥殘留的結果，根據丹參本身化學成分特性，按下述方式進行試驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

54種禁用農藥混和對照溶液(上海安譜科技有限公司，純度在 99.2%～99.5%，批號為2102078-2102076)；乙腈為質譜純；甲醇為色譜純；水為超純水；甲酸為色譜純；L(+)-抗壞血酸；1，4-二硫代-DL-蘇糖醇；N-正丙基乙二胺為色譜純；氯化鈉、無水硫酸鈉為優級純；丹參藥材購于山東省臨沂市，經安徽中醫藥大學藥學院方成武教授鑒定為正品藥材。

1.2 儀器與設備

Agilent7000DGC/TQ氣質聯用質譜儀(美國安捷倫公司)；Agilent6470LC/TQ液質聯用質譜儀型(美國安捷倫公司)；MCM36型百萬分之一電子天平(賽多利斯公司)；EOAA-HM-01多管旋渦混合儀；ATY224型萬分之一電子天平(日本島津公司)；NE-24basic全自動氮吹儀；APE-16平行濃縮儀；DD-5MC低速大容量離心機；WL-100型打粉機。

1.3 色譜及質譜條件

1.3.1 氣相色譜-串聯質譜法 和2020版藥典規定方法類似，但增加了定性的同一種化合物離子對個數，確保同一個化合物為了最大限度地排除樣品的基質干擾。氣相色譜參數儀器型號Agilent 7000D；色譜柱VF-17 MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm(PN：CP8982)；進樣體積1 μL；進樣口溫度280 ℃，進樣模式為不分流進樣，0.75 min打開分流出口，50 mL/min。載氣模式為恒壓，壓力146 kPa。傳輸線溫度為310 ℃。升溫程序中：初溫60 ℃，5 min；第一階段，升溫速率40 ℃/min，溫度達到200 ℃；第二階段，升溫速率2 ℃/min，溫度達到230 ℃；第三階段，升溫速率25 ℃/min，溫度達到320 ℃保留時間3 min。

質譜參數：儀器型號Agilent7000GC-MS/MS，掃描模式MRM，離子化方式EI，離子源溫度280 ℃，四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min，MRM條件同藥典方法。

1.3.2 高效液相色譜-串聯質譜法 色譜條件：同樣的，和2020版藥典規定方法類似，增加了定性的同一種化合物離子對個數，確保同一個化合物為了最大限度的排除樣品的基質干擾。色譜柱：Agilent Porosell SB-C18(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)，柱溫40 ℃，進樣量3 μL，流動相A為含5 mM甲酸銨的的0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸溶液(含5 mM甲酸銨)∶乙腈=5∶95，按照2020版中國藥典要求進行梯度洗脫，后運行6 min。

質譜條件：極性為正極，干燥氣體溫度為280 ℃，干燥氣流為7 L/min，鞘層氣體溫度為350 ℃，氣體流量為11 L/min，霧化壓力(Psi)為40，毛細管電壓(V)為3 500，噴嘴電壓(V)為0(正極)，數據采集模式為MRM。

1.4 樣品前處理

1.4.1 對照溶液的制備 精密量取54種禁用農藥混和對照溶液(已標示各相關農藥品種的濃度)0.5 mL，另精密量取單標殺蟲瞇對照品200 μL，置20 mL棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得以甲胺磷2.5 mg/L為例的混合對照品儲備液。精密量取上述混合對照品儲備液10 mL置50 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得500 μg/L的混合對照品溶液。

1.4.2 GC-MS/MS用內標溶液的制備 精密稱定磷酸三苯酯對照品適量，加乙腈溶解并制成每1.0 mg/mL溶液，再次以乙腈稀釋定容至0.1 μg/mL。

1.4.3 空白基質溶液的制備 取丹參空白基質粉末，同供試品方法處理，得到空白基質溶液。

1.4.4 基質混合對照溶液的制備 精密量取空白基質溶液6份，每份取1.0 mL，40 ℃水浴濃縮至約0.6 mL，分別加入混合對照品溶液20 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、400 μL，加乙腈稀釋至1 mL，渦旋混勻，即得[1]。

1.4.5 還原溶劑的制備 精密稱定8.8 g VC或者0.77 g DTT，加水稀釋溶解，轉移并定容至50 mL容量瓶，搖勻，即得。

1.4.6 供試品溶液的制備 取供試品粉末過三號篩，精密稱定3 g，加入臨用新配的VC(抗壞血酸)或者DTT(1，4-二硫代-DL-蘇糖醇)150 μL，置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，添加回收的樣品需要加入混合標準品(如添加濃度為50 ppb，需加入2.5 ppm混標60 μL)，加入1%冰醋酸溶液15 mL和陶瓷均質子渦旋，保證藥材粉末充分浸潤，放置30 min，為了其在酸性條件下細胞膨脹，更易提取。再精密加入乙腈15 mL，渦旋振蕩5 min，渦旋速度至少500次/min。加入QuEChERS提取鹽包，能吸附基質中絕大部分干擾物(如有機酸、脂肪酸、碳水化合物)，渦旋震蕩3 min，再次冰浴冷卻10 min，之后再4 ℃低溫5 000 r/min離心5 min，取上清液9 mL，加入提前準備好的裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管中，渦旋震蕩5 min，渦旋速度至少500次/min，4 ℃低溫8 000 r/min離心5 min，精密吸取上清液5 mL，置氮吹儀上于40 ℃水浴，逐漸濃縮至約0.5 mL，添加內標物質200 μL，添加回收樣品和實際樣品均直接加乙腈定容1.0 mL?；|空白樣品先加入混合標準溶液后(如基質標濃度為50 ppb，則加入500 ppb混合標準溶液100 μL)，再加乙腈定容至1.0 mL。定容后的樣品，渦旋混勻，過0.22 μm的PTFE濾膜，過濾液取400 μL加入120 μL的水，混勻后，供LC-MS/MS檢測，注入液相色譜-串聯質譜儀，按外標標準曲線法計算。 剩下的過濾液取400 μL，加入100 ppb的內標三苯基磷酸酯120 μL，混勻后，供GC-MS/MS檢測，注入氣相色譜串聯質譜儀，按內標標準曲線法計算，即得。

2 結果

2.1 校準曲線考察

在設定的校準曲線濃度10～200 ng/mL范圍內(甲胺磷計)，丹參基質匹配校準曲線的線性關系良好，相關系數均在0.990～0.999之間，表明方法校準曲線線性良好。

表2 對照品逐級稀釋及校準曲線配制表

2.2 定量限考察

以丹參空白基質匹配標準曲線最低點作為丹參33種農藥殘留檢測方法的定量限，僅為2020版中國藥典0212通則要求定量限的1/2～1/15，表明該測試方法靈敏度良好，能完全滿足2020版中國藥典規定的定量限要求。

2.3 專屬性考察

在上述“1.3”項下色譜條件進樣，其LC-MS/MS與GC-MS/MS所出峰的踏板數分離度等均滿足要求，丹參空白基質無干擾峰存在。

圖1 LC-MS/MS空白基質圖譜

圖2 LC-MS/MS丹參樣品圖譜

圖3 LC-MS/MS 33種農藥殘留標準品最低點圖譜

圖4 GC-MS/MS空白基質圖譜

圖5 GC-MS/MS丹參樣品圖譜

圖6 GC-MS/MS 33種農藥殘留標準品最低點圖譜

2.4 精密度與重復性考察

選擇篩選好的丹參空白基質，以2020版藥典規定的定量限濃度加標，平行6次，精密度結果RSD為2.0%～13.5%；按上述方法同時處理6批丹參樣品，所測33種農藥殘留的重復性結果的RSD在2.3%～11.4%范圍內。表明測試方法精密度與重復性均滿足要求。

2.5 準確度考察

2020版中國藥典規定33種農藥殘留的回收率范圍應在70%～120%，但由于有些藥材化學成分不一，重復性符合要求，部分農藥殘留的回收率亦可在60%～130%，上述丹參的33種農藥殘留化合物加標回收率為72.5%～110.2%，均滿足要求。

表3 丹參的33種農藥殘留化合物加標回收結果匯總

3 討論

針對丹參本身化學成分特性，加入臨用新配的VC(抗壞血酸)或DTT(二硫蘇糖醇)，降低其氧化能力，避免其與33種農藥殘留提取試劑的反應，通過上述結果可以發現其線性關系、檢測限、系統適應性、精確性、重復性、準確性均符合2020版中國藥典要求，可以作為丹參33種農藥殘留的檢測。

現有的2020版中國藥典規定檢測33種農藥殘留時需要氣相色譜-串聯質譜法與高效液相色譜-串聯質譜法共同檢測，均需要精密吸取對應處理方式的基質混合對照溶液及供試品溶液各1 mL，即需要按照要求分別準備兩種供試液，現有方法只需要處理一份即可滿足需求，提高了處理效率。

丹參作為單基源中藥材，在進行33種農藥殘留量檢測時發現，同一批丹參，以不同產地的丹參空白基質為參照，部分化合物所得結果及其回收率差異較大。2020版中國藥典規定經檢測不含待測農藥殘留的相同品種中藥材為其空白基質，但經過大量測試發現，只有采用同一基源、同一產地的空白基質才能最大限度地降低藥材的基質效應。