海口市兒童肺炎患者呼吸道標本流感嗜血桿菌的耐藥性與分子流行病學特征

麥文慧，尹飛飛，卓珠琳，鄭 青，陳柳虹

(1. 海口市婦幼保健院檢驗科，海南 海口 570203； 2. 海南醫(yī)學院-香港大學熱帶傳染病聯(lián)合實驗室，海南 海口 571199； 3. 海口市第三人民醫(yī)院檢驗科，海南 海口 571100)

流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)主要定植在咽喉及口腔黏膜，當機體免疫功能低下時，可引起急性咽炎、喉炎、氣管炎、肺炎、中耳炎、鼻竇炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、腦膜炎等急性化膿感染及嚴重的繼發(fā)感染[1]。流感嗜血桿菌是引起兒童呼吸道感染的主要病原菌，其感染人群、流行季節(jié)、耐藥性等均呈現(xiàn)地域性差異[2-3]。流感嗜血桿菌是海口地區(qū)引起兒童呼吸道細菌感染的首位病原體[4]，嚴重危害該地區(qū)兒童健康。為進一步了解海口地區(qū)兒童肺炎來源的流感嗜血桿菌臨床特征、耐藥性，以及其群體結構、克隆在社區(qū)傳播情況，對2021年海口市婦幼保健院住院肺炎患兒分離的流感嗜血桿菌進行研究，旨在為該地區(qū)預防和治療兒童流感嗜血桿菌性肺炎提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2021年因肺炎在海口市婦幼保健院住院治療的患兒為研究對象，分析患兒痰、肺泡灌洗液標本細菌培養(yǎng)出流感嗜血桿菌情況，剔除同一患兒同次住院重復菌株。兒童社區(qū)獲得性肺炎(CAP)診斷標準參照2019年版《兒童社區(qū)獲得性肺炎診療規(guī)范》[5]。患兒入院后24 h內(nèi)通過一次性無菌吸痰管負壓吸取痰標本送檢，痰合格標準為：白細胞>25個/低倍視野，鱗狀上皮細胞<10個/低倍視野。對于肺部感染導致的肺實變、肺不張患兒，通常進行支氣管肺泡灌洗治療，并取灌洗液送檢。隨機留取流感嗜血桿菌感染高發(fā)的春季中1—2月份分離的流感嗜血桿菌菌株，進行多位點序列分型(MLST)同源性檢測分析。

1.2 儀器與試劑 哥倫比亞血平板、嗜血桿菌巧克力平板、MH平板購自廣州迪景微生物科技有限公司，HTM平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司，細菌鑒定采用法國梅里埃VITEK 2全自動細菌鑒定分析儀及其配套的NH鑒定卡，頭孢硝噻吩紙片、因子紙片購自溫州康泰生物科標技有限公司，藥敏紙片購自英國OXOID公司和溫州康泰生物科技有限公司，標準菌株流感嗜血桿菌ATCC 49247、嚙蝕艾肯菌ATCC BAA-1152、金黃色葡萄菌ATCC 29213、金黃色葡萄菌ATCC 25923、副流感嗜血桿菌等均購自溫州康泰生物科技有限公司，PCR擴增儀、PCR反應試劑、電泳儀、凝膠程序成像系統(tǒng)、引物合成、測序等均由武漢天一華煜基因科技有限公司提供。

1.3 培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗 標本接種于哥倫比亞血平板和嗜血桿菌巧克力平板，置5%CO2培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)過夜，挑取巧克力平板上濕潤、透明的露滴狀疑似菌落采用Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子生長需求試驗進行初篩，初篩陽性菌株用梅里埃VITEK 2 Compact細菌鑒定儀及其配套的NH卡鑒定確認。挑取流感嗜血桿菌調(diào)成0.5麥氏單位菌懸液均勻涂布于HTM平板上，采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，結果判讀按照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2021標準進行。采用嚙蝕艾肯菌ATCC BAA-1152對NH鑒定卡進行質(zhì)量控制，采用流感嗜血桿菌ATCC 49247、副流感嗜血桿菌對Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子紙片進行質(zhì)量控制，采用流感嗜血桿菌ATCC 49247對HTM平板及K-B法藥敏紙片進行質(zhì)量控制。

1.4 β-內(nèi)酰胺酶檢測 采用頭孢硝噻吩紙片蘸取待測菌，10 min后觀察顏色變化，出現(xiàn)紅色為陽性，即產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶；1 h后無顏色變化為陰性，即不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶。采用金黃色葡萄菌ATCC 29213進行陽性質(zhì)控，金黃色葡萄菌ATCC 25923進行陰性質(zhì)控。

1.5 MLST (1)細菌DNA提取：采用煮沸法。吸取100 μL DNA提取液于離心管中，直接挑取流感嗜血桿菌菌落于DNA提取液中制成懸液，將離心管置于金屬加熱器中100℃ 10 min，再置于高速離心機12 000×g離心5 min，取上清液(即為DNA模板)4℃保存?zhèn)溆谩?2)PCR擴增：反應總體積30 μL，包括MasterMix 15 μL，無菌水12 μL，上游引物(濃度10 mmoL)、下游引物(濃度10 mmoL)各1 μL，DNA模版1 μL。反應條件為95℃預變性5 min，95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃末端延伸5 min。取2 μL PCR產(chǎn)物加2 μL 6×Loading Buffer進行電泳前處理，再取適量樣品至1%瓊脂糖凝膠孔中，120 V電泳20 min，采用凝膠成像分析儀進行拍照檢測。見表1。(3)測序分型：將PCR產(chǎn)物連同相應的測序引物送Sanger測序公司進行雙向測序(每個樣品配5 μL上、下游測序引物，引物濃度10 μmoL)，測序平臺為ABI公司的3730xl DNA Analyzer測序儀。測序結果提交MLST數(shù)據(jù)庫(http://enterobase.warwick.ac.uk/species/index/mcatarrhalis)，獲得各等位基因序列號并確定菌株序列型(sequence type，ST)。

表1 流感嗜血桿菌擴增/測序引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 Amplification/sequencing primer sequences and product sizes of H. influenzae

1.6 統(tǒng)計學方法 應用WHONET 5.6軟件對藥敏結果進行統(tǒng)計處理，應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 5 342例患兒共檢出流感嗜血桿菌352株，檢出率為6.59%。其中男患兒檢出率為7.10%，女患兒檢出率為5.82%，見表2。男女患兒流感嗜血桿菌檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.066)。送檢標本中，痰標本5 325份，肺泡灌洗液標本17份，分別檢出流感嗜血桿菌349、3株，檢出率分別為6.55%、17.65%。

2.2 不同年齡段檢出情況 流感嗜血桿菌檢出率以4歲～最高(12.88%)，2歲～次之(11.62%)，≥6歲為2.56%，<30 d最低(0.30%)，各年齡段比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 不同季節(jié)檢出情況 流感嗜血桿菌全年均可流行，春季(1～3月)、夏季(4～6月)、秋季(7～9月)、冬季(10～12月)流感嗜血桿菌檢出率分別為14.04%、4.48%、4.62%、4.40%，以春季檢出率最高,見表2。不同季節(jié)檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

表2 肺炎患兒流感嗜血桿菌臨床分布Table 2 Clinical distribution of H. influenzae in children with pneumonia

表3 331株流感嗜血桿菌對抗菌藥物的藥敏結果Table 3 Antimicrobial susceptibility testing results of 331 H. influenzae strains

圖1 流感嗜血桿菌序列峰圖Figure 1 Sequence peak of H. influenzae sequences

圖2 51株流感嗜血桿菌MLST聚類樹Figure 2 MLST cluster tree of 51 H. influenzae strains

3 討論

本研究從肺炎患兒收集5 342份標本，排除咽拭子，以痰標本為主，且痰為負壓吸取，減少了口咽部菌群的污染，數(shù)據(jù)更能客觀反映下呼吸道感染的情況。共檢出352株流感嗜血桿菌，總檢出率為6.59%，肺泡灌洗液檢出率為17.65%，遠高于痰的6.55%，說明肺泡灌洗液對下呼吸道感染具有較高的敏感度和特異度。本研究流感嗜血桿菌總檢出率比浙江嘉興地區(qū)(3.34%)高[3]，但比浙江玉環(huán)市(11.86%)[6]、山東濟南地區(qū)(12.58%)[7]、河南濟源市(10.94%)均低[8]，可見不同地區(qū)的流感嗜血桿菌流行存在地域性差異。林翀等[9]報道2012年海口地區(qū)檢出率為18.6%，說明同一地區(qū)不同年度流感嗜血桿菌的感染流行也不同。流感嗜血桿菌的流行不僅呈季節(jié)性分布，各地區(qū)的流行季節(jié)也不盡相同。與文獻[6，10]報道的冬季檢出率最高不同，海口地區(qū)春季檢出率最高，冬季檢出率最低，與袁文清等[11]報道一致，多個研究報道春季有較高檢出率[7-8，11-12]，可能是春季冷暖交替，容易誘發(fā)流感嗜血桿菌相關呼吸道疾病，加上春季正值春節(jié)期間，人員流動性大，增加了感染風險。臨床應重視春季此類疾病的防控，積極開展社區(qū)宣傳工作，指導家屬做好兒童防護工作。

本研究發(fā)現(xiàn)，新生兒流感嗜血桿菌檢出率僅0.24%，檢出率低的原因可能是新生兒與外界接觸少，大多數(shù)新生兒肺炎都是吸入性肺炎，感染多由宮內(nèi)感染或經(jīng)產(chǎn)道感染，接觸的細菌多為定植菌，與2020年該院統(tǒng)計的數(shù)據(jù)[4]一致。本研究發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌感染患兒沒有男女性別差異，年齡集中在30 d～8歲，并且各年齡段之間存在差異，90%的感染發(fā)生在5歲以下兒童。30 d～患兒的病例數(shù)和流感嗜血桿菌構成比最高，但是檢出率不高，檢出率最高的年齡段是4歲～，其次是2歲～，≥6歲病例數(shù)明顯降低，此現(xiàn)象可能與學齡前兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未健全，免疫功能低下有關，年齡、性別差異與全國多個地區(qū)報道[6-8，11，13]一致。1～5歲兒童流感嗜血桿菌感染率高，估計與此年齡段兒童開始從家庭走進社區(qū)，與外界接觸增多，感染風險也增加，也間接證明了流感嗜血桿菌克隆在社區(qū)傳播。

MLST通常被用于細菌的基因分型，判定菌株親緣關系，了解細菌的群體結構及分子流行病學特點。本研究中，51株流感嗜血桿菌被分為15個ST型，10個克隆群，其中ST107是海口地區(qū)春季優(yōu)勢克隆群，其次是ST422、ST103和ST57,另外有5個獨立ST型。由此可見，不同個體分離的流感嗜血桿菌ST型具有較大的差異，說明本地區(qū)流感嗜血桿菌的流行具有較多的遺傳多樣性，且具有克隆傳播趨勢。不足的是，本次用于MSLT的菌株數(shù)少，沒有覆蓋全年各個時間點，無法進行季節(jié)性分子流行病學比較。另外，國內(nèi)尚未見流感嗜血桿菌的分子流行病學的文獻，暫時無法進行地域性分子流行病學比較。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。