蒙藥古日古木-13對CCl4誘導的大鼠肝纖維化的改善作用及其機制研究

道力格瑪，鄧烏力吉，薩礎拉，薩日呼，陳圓圓，寶特力格爾，包套格申

(1.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110；2.內蒙古醫科大學附屬人民醫院，內蒙古 呼和浩特010020)

肝纖維化 (Hepatic fibrosis，HF)是以細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)過度堆積和結蹄組織異常增生為主要特征的肝臟病理過程[1]，通常由慢性炎癥損傷愈合反應引起。如果治療不及時，肝纖維化的持續發展將誘使肝硬化，最終導致肝功能衰竭甚至死亡，故應注重抗肝纖維化的治療。研究發現肝纖維化過程具有可逆性，在早期階段進行有效治療對防止肝病發展至關重要[2]。近年來很多學者致力于天然藥物抗肝纖維化的研究，發現中醫藥在肝纖維化的治療中具有多途徑、多靶向、多層次的治療優勢[3]。

蒙藥古日古木-13始載于蒙醫《四部醫典》，是蒙醫臨床治療肝病的經典藥方[4]，由紅花、麥冬、木香、丁香、蓮子、訶子、川楝子、梔子、紫檀香、麝香、人工牛黃、人工水牛角濃縮粉、銀朱等13味蒙藥組成。以紅花為主藥，具有清肝熱、解毒、殺黏作用，主治肝功衰退、腰腎損傷及眼病。郭躍東等[5]發現古日古木-13對酒精性肝損傷大鼠Bax蛋白的表達有抑制作用，而增強Bcl-2蛋白表達，可減少肝細胞凋亡，從而抑制酒精性肝損傷大鼠的肝纖維化。葉超凡等[6]發現古日古木-13能明顯減輕CCl4所致肝損傷小鼠的肝組織壞死浸潤灶、肝細胞變性、壞死及炎細胞浸潤等病變，促進肝臟組織ALR蛋白表達，進而維持肝細胞膜的穩定性。但現有文獻關于古日古木-13對肝纖維化的重要因子TGF-β1和α-SMA的作用機制的研究較少。本實驗擬復制CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型，通過觀察蒙藥古日古木-13對肝纖維化的改善作用，探究其潛在作用機制。

1 實驗動物及材料

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠60只，體質量(180±20)g，購自北京海淀區興隆實驗動物養殖廠(合格證編號：SCXK(京)2019-00010)。實驗大鼠在溫度(20±2)℃、濕度(55±5)℃、12 h明暗循環環境的條件下，適應性喂養1周。

1.2 儀器

RM2235病理切片機(德國徠卡)；MULTISKAN MK3全自動多功能酶標儀(塞默飛世爾科技公司)；AU480全自動生化儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)；JY300C電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；StepOne Plus實時定量PCR儀(美國應用生物系統公司)。

1.3 藥材與試劑

古日古木-13(批號：2005007)購自內蒙古蒙藥股份有限公司，秋水仙堿(批號：CC30152550)購自武漢豐泰威遠科技有限公司；四氯化碳(批號：20180218)天津永晟精細化工有限公司；ALT、AST試劑盒，英科新創(廈門)科技有限公司；HA試劑盒(批號：CGEKR91LVA)、LN試劑盒(批號：8C2MD5XJHJ)、PⅢNP試劑盒(批號：TKDCTVDZVV)，武漢華美生物工程有限公司；qPCR試劑盒(批號：KK4601)，默瑞(上海)生物科技有限公司；兔抗大鼠α-sma多克隆抗體(批號：bs-10196R)，北京博奧森生物技術有限公司。

2 方法

2.1 分組與造模

將60只雄性SD大鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，陽性對照組和古日古木-13低、中、高劑量組，每組10只。除空白對照組給予生理鹽水外，其他各組腹腔注射60%CCl4橄欖油溶液，2 mL/kg，每周2次，共 7周。

2.2 給藥

自第4周起，在繼續造模的同時，古日古木-13低、中、高劑量組大鼠分別給予128 mg/kg、256 mg/kg和512 mg/kg劑量藥物灌胃，藥物濃度及等效劑量通過體表面積折算。陽性組大鼠以秋水仙堿0.2 mg/kg為劑量灌胃給藥[7]。空白組和模型組根據大鼠體質量灌胃相同劑量的生理鹽水，各組大鼠灌胃量為10 mL/kg，1次/d，持續4 周。末次給藥后，禁食過夜，次日采血并收集肝臟組織。

2.3 檢測指標與方法

2.3.1 檢測肝功能及纖維化指標 末次給藥后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛予以麻醉，腹主動脈取血，血液以3 000 r·min-1、15 min離心，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存以備檢測；依照試劑盒說明書的操作方法，采用生化檢測法測定血清 ALT和AST水平，ELISA法檢測血清HA、LN和PⅢNP表達。

2.3.2 組織病理學檢查 采用10%中性福爾馬林固定肝臟組織，經乙醇脫水及石蠟包埋等步驟后，采用常規方法進行HE染色，封片，生物顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

2.3.3 實時熒光定量PCR檢測 切取大鼠同一部位肝組織，置于冷凝管迅速放入液氮速凍，待充分冷凍后儲存于-80 ℃冰箱。PCR反應采用2×SYBR Master Mix Universal 10 μL反應體系，總體積：20 μL，Forward Primer 1.5 μL(10 μm)，Reverse Primer 1.5 μL(10 μm)，template 3 μL，ROX校正染料0.5 μL，H2O 補齊至20 μL，用 SYBR PCR Mixture進行擴增，95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、59 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s、95 ℃ 15 s。引物序列，見表1。

表1 PCR引物序列

2.3.4 免疫組化檢測 大鼠肝組織常規包埋切片，置于 EDTA8.0修復液中，微波爐內修復，沖洗后室溫下放入3%雙氧水孵育30 min，PBS沖洗3次，滴加牛血清白蛋白V工作液孵育30 min，滴加一抗(α-SMA 1∶500)4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，滴加相應二抗，PBS沖洗3次，DAB染色，蒸餾水充分沖洗后，蘇木素復染，用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，采用中性樹膠封片。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，分析每個組織片上α-SMA平均光密度值，并在200倍下拍照觀察，再進行定性分析。

2.4 數據處理

3 結果與分析

3.1 大鼠行為學特征及組織變化

實驗期間，空白組大鼠情況良好，各造模組自造模第2周起出現毛色發黃、失光澤，精神狀態差，甚至出現腹水等變化。給藥期間陽性組，古日古木-13各劑量組大鼠毛色、活躍度等情況有所改善。采集肝臟組織樣本時觀察到空白組大鼠肝臟組織與其他各組有明顯區別，主要體現在顏色鮮紅、表面光滑細膩、無結節、質嫩、邊緣銳利。模型組大鼠肝臟顏色呈褐色，表層粗糙欠光滑，質硬，肝臟邊緣鈍厚，部分肝臟有花斑樣改變，肝葉體積增大，個別大鼠肝臟顆粒樣變化嚴重，甚至肝臟分葉不明顯；給藥組肝組織與模型組相比，變化不大。

3.2 對肝功能指標的影響

與空白組比較，模型組血清ALT、AST水平顯著提高(P<0.05)。與模型組比較，陽性組相較古日古木-13各劑量組，ALT、AST水平有降低趨勢，但不明顯。見圖1。

注：與空白組比較，#P<0.05。

3.3 對肝纖維化指標的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清HA、LN、PⅢNP水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性組較古日古木-13低、高劑量組，血清HA含量顯著降低(P<0.01)；陽性組較古日古木-13低、中劑量組，大鼠血清LN含量顯著降低(P<0.05)；陽性組、古日古木-13各劑量組大鼠血清中PⅢNP含量顯著降低(P<0.05)。見圖2。

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 對大鼠肝臟組織形態的影響

HE染色鏡下觀察，空白組肝組織具有完整的肝小葉結構，中央靜脈清晰，肝索呈放射狀，中央靜脈周圍未見壞死、炎癥或纖維化跡象。模型組大鼠肝組織嚴重損傷，肝小葉結構被破壞，有明顯的脂肪變性，肝臟有膠原纖維沉積。與模型組相比，陽性組和古日古木-13各劑量組部分區域膠原沉積明顯改善，肝細胞脂肪變性減少，匯管區內仍可見炎細胞浸潤，細胞炎癥明顯減輕，肝細胞壞死顯著減少，見圖3。

注：A 空白組；B 模型組；C 陽性組；D古日古木-13低劑量組；E古日古木-13中劑量組；F古日古木-13高劑量組。

3.5 對大鼠肝組織TGF-β1的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織TGF-β1表達顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，古日古木-13高劑量組大鼠肝組織TGF-β1表達量明顯下降，差異有顯著統計學意義(P<0.01)，見圖4。

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.6 對CCL4誘導大鼠HSCs活化的抑制作用

與空白組比較，模型組大鼠肝組織α-SMA表達顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性組、古日古木-13各劑量組大鼠肝組織α-SMA表達均顯著下降(P<0.05)；抗原陽性表達為棕黃色，細胞核為藍色。見圖5、圖6。

注：A 空白組；B 模型組；C 陽性組；D古日古木-13低劑量組；E古日古木-13中劑量組；F古日古木-13高劑量組

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 結語

肝纖維化在人群中較為多發，也是肝細胞癌(HCC) 衍變的關鍵環節，是不可輕視的健康問題。現階段暫無肝纖維化的特異性檢測方法，血清學指標仍是臨床上運用較廣泛的無創性診斷手段。HA是ECM的重要組成部分，當肝纖維化時HA合成增加，同時，肝細胞攝取和分解HA的能力也因肝功能受損降低，從而顯著增加血清HA水平[9]。LN是一種非膠原性糖蛋白，是基底膜的主要成分，在肝纖維化時聚集沉積，血清值升高反映基底膜更新率的增加[10]。血清PⅢNP是完整的Ⅲ型前膠原分子，直接反映了Ⅲ型膠原的合成情況[11]。CCl4誘導的肝纖維化大鼠血清HA、LN及PⅢNP水平顯著升高，提示肝纖維化模型建立成功。本研究中，經過蒙藥古日古木-13的干預，肝纖維化大鼠血清中HA、LN和PⅢNP表達顯著降低。通過組織病理學和血液生化檢測發現肝纖維化大鼠肝臟組織形態變化明顯，同時肝纖維化大鼠血清中AST、ALT水平有下降趨勢。這些均表明蒙藥古日古木-13對CCl4誘導的實驗性肝纖維化具有積極改善作用，提示顯著降低膠原纖維的合成與沉積是改善肝纖維化的可能機制之一。本實驗采用60%CCl4橄欖油溶液進行造模，結果顯示實驗后期大鼠有精神不振、腹部脹氣，甚至腹水等癥狀，這可能與四氯化碳濃度較高有關。

活化的肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)將分化為成纖維母細胞，產生大量的ECM，是肝纖維化過程中負責膠原蛋白合成的主要細胞類型。在HSC增生和激活過程中諸多細胞因子起調控作用。越來越多的證據表明，TGF-β1在肝纖維化中扮演著重要角色[12-13]。TGF-β1經庫普弗細胞分泌產生，它能激活HSC，同時促使HSC自分泌TGF-β1[14]。蒙藥古日古木-13高劑量能顯著降低肝組織中TGF-β1的表達，表明蒙藥古日古木-13抑制肝纖維化的機制可能與TGF-β1細胞因子有關。然而，由于本實驗給藥周期較短，蒙藥古日古木-13低、中劑量和陽性組與模型組相比無明顯差異，但均對肝纖維化大鼠TGF-β1水平有下調作用。α-SMA的異常表達已被認為是肝星狀細胞活化的可靠標志物[15]，蒙藥古日古木-13可顯著降低大鼠肝纖維化肝組織α-SMA的表達，提示蒙藥古日古木-13可能通過抑制肝星狀細胞的活化，進而降低ECM的合成。

綜上所述，本研究認為蒙藥古日古木-13改善肝纖維化的主要作用機理可能是阻止星狀細胞活化，抑制星狀細胞自分泌的TGF-β1肝纖維化促進因子，進而減少ECM的過度增生、沉積，從而發揮了改善肝纖維化的作用。