基于HPLC與NIRS指紋圖譜及多元統計分析山茱萸炮制前后差異

方瑩潔，江 姍，杜偉鋒，*，葛衛紅，李昌煜，張葉峰，張光霽

(1.浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司，浙江 杭州 311401；2.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 311402；3.寧波市中藥飲片有限公司，浙江 寧波 315336)

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉[1-2]，其始載于《神農本草經》，被列為上品，宋代《蘇沈》有“酒浸潤，蒸透去核取其皮”的記載，元代《活幼心書》記載了酒蒸炮制方法：“酒浸潤，蒸透”[3]。目前，臨床上常用山萸肉、蒸萸肉以及酒萸肉入藥，山萸肉斂陰止汗作用強；蒸萸肉補腎澀精、固精縮尿力勝；酒萸肉借酒力溫通，滋補作用強于清蒸品[4]。

現行2020年版《中國藥典》[1]從顏色、氣味以及含莫諾苷、馬錢苷總量上對山萸肉和酒萸肉進行了區分，但不足以體現炮制的特征。山茱萸炮制特征的研究主要集中在炮制前后的指紋圖譜及特征性成分的變化。林碧珊等[5]建立了山茱萸炮制前后的UPLC特征圖譜，并指認了沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷和馬錢苷4個化合物，該方法可以用來區分山茱萸生品和制品；本課題組前期也建立了山茱萸炮制前后的HPLC指紋圖譜[6]，并指認了6個特征性成分，分別為沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、獐牙菜苷、馬錢苷和山茱萸新苷，并對炮制前后特征性成分的含量變化進行了研究分析[7-8]。近幾年，在中藥材的定性定量快速分析領域，近紅外顯示出顯著的優越性，涌現出諸多有關山茱萸的近紅外研究[9-11]。本實驗在前期研究的基礎上，優化了HPLC指紋圖譜方法，并將HPLC指紋圖譜與NIRS指紋圖譜相結合，通過多元統計分析建立了更加完善的定性分析方法，從色譜、光譜以及數學分析上為山茱萸生品與制品的綜合質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent-1200高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ME204E型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；Thermo Antaris II型傅立葉變換近紅外光譜儀(美國Thermos公司)。

1.2 試藥

對照品沒食子酸(批號：110831-201906，純度≥91.5%)、莫諾苷(批號：111998-201703，純度≥92.4%)、馬錢苷(批號：111640-201808，純度≥98.6%)均購自中國食品藥品鑒定研究院;獐牙菜苷(批號：DST190926-014，純度≥98%)購自樂美天醫藥德斯特生物;5-羥甲基糠醛(5-HMF)(批號：Q-042-180112，純度≥98%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司;山茱萸新苷(批號：190104-202103，純度≥98%)購自上海鴻永生物科技有限公司；乙腈為色譜純；其余均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

山茱萸來源見表1，S1～S21為山茱萸生品山萸肉，Z1～Z21為山茱萸制品酒萸肉，均按照2020年版《中國藥典》加工炮制，并經浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司主管中藥師錢敏鑒定為山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉的炮制加工品。

表1 山茱萸來源

2 方法與結果

2.1 HPLC指紋圖譜分析

2.1.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫：0～50 min，2%～13%A；50～85 min，13%～25%A；流速為1 mL·min-1；檢測波長240 nm。柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取樣品粉末(過三號篩)0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱重，超聲提取(250 W，20 kHz)30 min(加冰袋保持恒溫)，補重，搖勻，過濾，續濾液用0.45 μm濾膜過濾備用。

2.1.3 對照品溶液制備 取莫諾苷、沒食子酸、山茱萸新苷、獐牙菜苷、5-HMF、馬錢苷對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成混合對照品溶液，對照品濃度分別為5.36 μg/mL、19.37 μg/mL、1.97 μg/mL、16.97 μg/mL、5.11 μg/mL、2.12 μg/mL。

2.1.4 精密度試驗 按上述色譜條件連續進樣同一批樣品溶液(Z1)6次，記錄色譜圖。以莫諾苷峰為參照峰，計算6個特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結果6個特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD<2%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重現性試驗 按上述方法制備6份供試品溶液(Z1)，分別進樣，記錄色譜圖。以莫諾苷峰為參照峰，計算6個特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結果6個特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD<2%(n=6)，表明方法重復性好。

2.1.6 穩定性試驗 分別于 0、2、4、6、8、10、12 h按上述色譜條件進樣同一批樣品溶液(Z1)，記錄色譜圖。以莫諾苷峰為參照峰，計算6個特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結果6個特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD<2%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.1.7 指紋圖譜建立 對本次收集到21批山萸肉樣品和21批酒萸肉樣品，按“2.1.2”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，精密吸取供試品溶液10 μL，分別進樣，記錄色譜圖。根據結果，運用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版》進行分析，山萸肉的對照指紋圖譜與21批共有模式的指紋圖譜見圖1、圖2，共檢測到14個共有色譜峰，與對照品(圖5)比對指認其中5個特征峰：2號峰(沒食子酸)、7號峰(莫諾苷)、10號峰(獐牙菜苷)、11號峰(馬錢苷)和14號峰(山茱萸新苷)。酒萸肉的對照指紋圖譜與21批共有模式的指紋圖譜見圖3和圖4，共檢測到17個共有色譜峰，與對照品(圖5)比對指認其中6個特征峰：4號峰(沒食子酸)、5號峰(5-HMF)、10號峰(莫諾苷)、12號峰(獐牙菜苷)、13號峰(馬錢苷)、17號峰(山茱萸新苷)。

注：2.沒食子酸；7.莫諾苷；10.獐牙菜苷；11.馬錢苷；14.山茱萸新苷。

圖2 21批山茱萸生品的指紋圖譜

注：4.沒食子酸；5.5-羥甲基糠醛；10.莫諾苷；12.獐牙菜苷；13.馬錢苷；17.山茱萸新苷。

圖4 21批山茱萸制品指紋圖譜

注：1.沒食子酸；2.5-羥甲基糠醛；3.莫諾苷；4.獐牙菜苷；5.馬錢苷；6.山茱萸新苷。

2.1.8 指紋圖譜數據評價 運用相似度評價系統以對照指紋圖譜為參照，分別計算山萸肉和酒萸肉的相似度，見表2和表3。結果顯示，山萸肉所有批次相似度均>0.998，相似度好；酒萸肉所有批次相似度均>0.888，相似度較好。酒萸肉相似度值相對較低，可能是由于各飲片公司的炮制條件有所差異，從而導致制品內部存在差異。

表2 21批山茱萸生品指紋圖譜相似度結果

表3 21批山茱萸制品指紋圖譜相似度結果

2.2 多元統計分析

2.2.1 聚類分析 以6個特征性成分的相對峰面積為變量，應用SPSS 25.0軟件進行聚類分析，采用中位數聚類法，以平方歐式距離作為樣品相似度的測度，聚類結果見圖6。由圖6可知，當距離為15時，分為兩大類，1～21樣品為1類(均為生品)，22～42為1類(均為制品)；當距離為10時，分為3類，1～21樣品為1類(均為生品)，28、35、36、38為1類(均為制品)，22～27、29～34、37、39～41為1類(均為制品)；而距離為5時，生品1～21仍聚為1類，制品區分為4類。以上可以說明，不同飲品公司的山茱萸生品內部差異性不大，而制品內部差異性較大。

圖6 聚類分析樹狀圖

2.2.2 主成分分析 以6個特征峰的峰面積為變量，應用SPSS 25.0軟件進行主成分分析，主成分特征值及方差貢獻率見表4。當提取到第2個成分時，累計方差貢獻率達到87.387%，且兩個特征值>1，解釋了總方差87.387%的信息。第1主成分的信息主要由色譜峰沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷和山茱萸新苷組成：第2主成分的信息由色譜峰獐牙菜苷和馬錢苷組成，見表5。將6個特征成分的峰面積導入SIMCA 14.1軟件，選擇2個主成分，繪制得到主成分分析得分圖，見圖7。該結果與聚類分析的結果一致，生品聚為1類，制品聚為1類，其中27和37兩個樣品分散的較遠，結合聚類分析，能夠證明制品與生品具有明顯差異，生品內部差異不明顯，制品內部差異較大。

表4 山茱萸樣品主成分特征值及方差貢獻率

表5 山茱萸樣品主成分分析載荷矩陣

圖7 主成分分析得分

2.3 近紅外定性模型分析

2.3.1 近紅外圖譜采集 取樣品粉末(過三號篩)約10 g，放入石英樣品杯中，混合均勻并攤平，扣除參比(內置背景)，采集所有樣品的光譜圖。以積分球漫反射為采樣方式，波數區間在4 000～10 000 cm-1之間，分辨率為8.0 cm-1，溫度控制在(25±2)℃，相對濕度控制在45%～50%之間。每份樣品掃描3次，取其平均光譜作為樣品的近紅外光譜。得到山茱萸的近紅外光譜疊加圖，見圖8、圖9、圖10。

2.3.2 判別分析模型建立 采用TQ Analyst軟件對山茱萸光譜進行判別分析，以所建模型的性能指數(Performance index，PI)為指標，首先選擇多元散射校正(MSC)光程類型，比較原始光譜(Spectrum)圖、一階求導(First derivative，1stD)圖、二階求導(Second derivative，2stD)圖，見圖8、圖9、圖10，發現原始光譜圖在譜段7 000～10 000 cm-1之間有差異，一階求導光譜圖在譜段5 000～7 500 cm-1之間有差異，二階求導光譜圖在譜段5 000～7 500 cm-1之間有差異，相對來說一階求導圖和二階求導圖較為復雜，選用合適譜段較為困難，因此選用原始光譜圖的差異性譜段進行優化。第二步通過比較不同光譜預處理方法(不平滑(No smoothing，NS)、卷積平滑濾波(Savitzky-Golay filter，S-G)、Norris導數平滑濾波(Norris derivative filter，ND))進行篩選，不同光譜預處理方法建模的性能指數見表6，經比較，最終選擇譜段為7 000～10 000 cm-1，同時選用“SNV+Spectrum+NS”組合作為預處理方法。

圖8 原始光譜

圖9 一階求導光譜

圖10 二階求導光譜

表6 不同光譜預處理方法對性能指數的影響

2.3.3 判別分析結果 山茱萸判別分析結果見圖11。由圖11可知，山茱萸生品與制品有著明顯區分，模型區分度良好。相對來說，生品聚集的范圍較小，而制品較為分散，證明了生品與制品存在差異，而生品內部差異不明顯，制品內部差異較大。

圖11 山茱萸近紅外判別分析

3 討論

(1)本研究對HPLC指紋圖譜提取時間、柱溫和梯度洗脫條件進行了優化。在相同條件下，提取30 min和提取60 min所得到的色譜圖無明顯差異，因此選擇30 min作為最終提取時間；對30 ℃柱溫和35 ℃柱溫進行考察發現，柱溫維持35 ℃時的分離度相對更好，獐牙菜苷和馬錢苷更能加以區分；對供試品溶液進行全梯度洗脫時發現，山茱萸色譜峰的出峰時間比較靠前，相對應的流動相極性較大，因此對流動相梯度進行優化，選擇極性較大的梯度進行洗脫，節省了乙腈的用量。本研究得到的HPLC指紋圖譜方法與前期研究方法相比，縮短了樣品提取時間，減少了乙腈使用量，提高了色譜峰的分離度。通過對已知色譜峰峰面積進行聚類分析和主成分分析，即可將樣品區分為生品和制品。運用近紅外光譜技術，將采集到的近紅外光譜圖進行判別分析，通過不斷優化譜段范圍以及預處理方法，最終得到的判別模型區分度良好，性質穩定，能將生品聚為1類，制品聚為1類。

(2)本課題組前期通過HPLC-ESI-MS法分析發現，山茱萸經過炮制后增加了5-羥甲基糠醛這一化學成分[12]，通過對比山茱萸生品和制品的HPLC指紋圖譜，也可表明經過炮制后的山茱萸新增了5-羥甲基糠醛這一化學成分，基于此，本課題組又對炮制過程的樣品進行實驗發現，隨著炮制時間延長，5-HMF含量從無到有逐漸增加，增加到一定值逐漸趨于平緩。5-HMF是美拉德反應的副產物，是由葡萄糖或果糖脫水生成的化合物，結合前期研究，山茱萸制品的多糖含量相對于生品有所降低[13]，由此推測，在炮制過程中，山茱萸多糖水解轉化為單糖，單糖進一步脫水生成5-HMF。而5-HMF具有腎毒性[14-15]，研究表明，5-HMF對小鼠ICR急性毒性半數致死量(LD50)為871.12 mg·kg-1，按照化學物質毒性分級標準，5-HMF為3級毒性物質[14]，因此5-HMF有必要成為山茱萸炮制程度的一個重要指標。對其他成分進行含量比較發現，經過蒸制的山茱萸不論是清蒸還是酒蒸，莫諾苷和馬錢苷的含量均顯著下降，獐牙菜苷的含量略微增加，而沒食子酸的含量顯著升高[7-8]。而加酒蒸制和不加酒蒸制對山茱萸的影響還需進一步探究。

(3)本研究建立的HPLC和NIRS指紋圖譜聯用，并結合多元統計分析山茱萸質量的方法，能從色譜、光譜以及數理統計上較系統地將山茱萸分為生品和制品兩類，為整體評價山茱萸質量提供了一種簡便方法。基于此，本課題將繼續收集樣品，并結合已知成分的含量，建立更加客觀、便捷的定量分析方法，為山茱萸質量評價及臨床用藥提供更加科學的參考。