HPLC雙波長法同時測定金烏骨通膠囊中3種成分

史 娟，陳 貴，盧婭玲，安 軍，張 華，鄧言歡，吳 征

(黔南州檢驗檢測院，貴州 都勻 558000)

金烏骨通膠囊來源于傳統苗藥，由葛根、淫羊藿、補骨脂等十味中藥組成，功效為滋補肝腎、活血通絡、祛風除濕，用于治療骨質疏松、肝腎不足等癥[1-2]。金烏骨通膠囊現行質量標準中含量測定指標為葛根素，缺少淫羊藿及補骨脂有效成分的含量控制。淫羊藿苷是淫羊藿中主含的黃酮類有效成分，補骨脂素和異補骨脂素是補骨脂中主含的香豆素類有效成分，3種成分均作為含量測定指標廣泛應用于相應藥材及其制劑的質量控制，其中淫羊藿苷具有促進雌性激素合成、調節血脂、保護受損神經元等作用，補骨脂素和異補骨脂素具有促進骨生長和雌激素樣作用[3-6]。在報道的金烏骨通膠囊淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素三種成分含量測定研究中，由于采用甲醇-水系統作為流動相，補骨脂素和異補骨脂素出峰較快，不能和其他成分較好分離[7]。本文采用乙腈-水系統作為流動相，雙波長法同時測定金烏骨通膠囊中淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量，各成分均有較好的響應值，且分離度良好，為金烏骨通膠囊質量標準的提升提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260Ⅱ型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；AG135型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；DK-98-ⅡA型恒溫水浴鍋(天津市泰斯特公司)；SK250LHC型超聲儀(上?？茖Ч?。

1.2 材料

對照品：淫羊藿苷(批號：110737-202017，以98.1%計)，補骨脂素(批號：110739-201918，以99.6%計)，異補骨脂素(批號：110738-202016，以99.4%計)，均購于中國食品藥品檢定研究院；15批次金烏骨通膠囊樣品來源于藥品評價性抽檢，生產廠家為貴州盛世龍方制藥股份有限公司，具體信息見表1；狗脊、烏梢蛇、葛根、淫羊藿、木瓜、姜黃、威靈仙等陰性對照用飲片購于都勻市湘君大藥房，土牛膝、土黨參、補骨脂藥材由藥企提供，經黔南州檢驗檢測院陳貴主任藥師鑒定為正品，缺補骨脂和缺淫羊藿陰性對照樣品的制備參照金烏骨通膠囊質量標準中的處方和制法；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用安捷倫Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水(25∶75)為流動相；柱溫：20 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣10 μL；雙波長檢測：246 nm(用于兩種補骨脂素檢測)和270 nm(用于淫羊藿苷檢測)。

2.2 各溶液制備

2.2.1 對照品貯備液的制備 分別精密稱取3種對照品，用甲醇溶解并定容成每1 mL中含淫羊藿苷1 516.6 μg、補骨脂素1 257.0 μg和異補骨脂素1 529.8 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取適量的金烏骨通膠囊內容物，研細，取約1 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，置于水浴上回流30 min，放冷，再稱定重量，減失的重量用甲醇補足，濾過，取續濾液即得。

2.2.3 陰性供試溶液的制備 按處方組成及生產工藝，分別制備缺補骨脂和缺淫羊藿的兩種陰性供試品，照“2.2.2”項下方法分別制備相應的陰性供試品溶液。

2.3 專屬性及系統適應性試驗

取“2.2.2”和“2.2.3”項下3種溶液及“2.4”項下定容至50 mL的混合對照品溶液，照“2.1”項下條件進樣。結果表明供試品色譜圖中顯示與對照品相同保留時間的色譜峰，峰形較好，與相鄰峰分離度均大于1.5，理論塔板數按3種成分計算均大于6 000，陰性對檢測沒有產生干擾。HPLC色譜見圖1。

注：A.混合對照品(270 nm)；B.混合對照品(246 nm)；C.金烏骨通膠囊樣品(270 nm)；D.金烏骨通膠囊樣品(246 nm)；E.缺淫羊藿陰性對照(270 nm)；F.缺補骨脂陰性對照(246 nm)；1.淫羊藿苷；2.補骨脂素；3.異補骨脂素。

2.4 線性關系考察

分別取“2.2.1”項下的混合對照品貯備液1 mL置于10、25、50、100和200 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到5個濃度對照品溶液。取上述溶液按照“2.1”項下條件分別進樣測定，以各對照品的質量濃度為橫坐標(X)、其對應的峰面積為縱坐標(Y)作線性回歸，結果見表2。

表2 3種成分線性關系

2.5 精密度試驗

取“2.4”項下定容至50 mL的混合對照品溶液，照“2.1”項下條件重復進樣測定6次，結果淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素3種成分峰面積的RSD分別為0.06%、0.12%和0.05%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取金烏骨通膠囊樣品(批號：210117)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下條件分別測定供試品制備后0、2、4、6、8和12 h的含量，結果測得淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素3種成分含量的RSD分別為1.85%、0.39%和0.68%，表明供試品溶液在制備后12 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取金烏骨通膠囊樣品(批號：210117)，按“2.2.2”項下方法制得6份重復性試驗用溶液，照“2.1”項下條件測定，結果測得淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素3種成分含量平均值分別為0.609 mg/g、0.557 mg/g和0.757 mg/g，RSD分別為0.93%、0.18%和0.29%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

分別精密稱取3種對照品(淫羊藿苷10.09 mg、補骨脂素9.29 mg、異補骨脂素12.42 mg)置于500 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋制得加樣回收用貯備液。取適量的金烏骨通膠囊(批號：210117)樣品研細，精密稱取6份，每一份0.5 g，分別精密加上述加樣回收用貯備液15 mL，再分別精密加甲醇10 mL，稱重后回流提取30 min，放冷后再稱重，減失的重量用甲醇補足，濾過，取續濾液照“2.1”項下條件測定，分別計算3種成分的加樣回收率。結果見表3。

表3 3種成分加樣回收率測試結果 (n=6)

2.9 樣品測定

分別取不同批次的金烏骨通膠囊樣品，每批次稱取2份，供試品溶液按“2.2.2”項下方法制備，再按照“2.1”項下條件進樣，采用外標法計算，3種成分含量測定結果見表4。

表4 15批次金烏骨通膠囊樣品中淫羊藿苷等3種成分的含量測定結果

3 討論

3.1 檢測波長選擇

實驗在線采集淫羊藿苷等3種成分在200～400 nm范圍內的吸收光譜，結果淫羊藿苷在270 nm、兩種補骨脂素在246 nm處有最大吸收，在各自最大吸收波長處，各成分均有較好的響應值，且與相鄰成分均有效分離，因此采用246 nm和270 nm雙波長進行測定。

3.2 流動相選擇

實驗分別考察了甲醇-水(55∶45)和乙腈-水(30∶70)[8-10]作為流動相對3種成分分離的影響，結果在兩種流動相條件下分離效果均不理想，但后者略優于前者，當把流動相調整為乙腈-水(25∶75)時，3種成分均得到有效分離。

3.3 提取條件選擇

實驗對提取條件進行考察，分析不同條件對3種成分提取的影響。提取方式考察超聲和回流提取，提取溶劑考察稀乙醇、70%甲醇和甲醇，結果3種溶劑在回流條件下均有較好提取，其中以甲醇效果最好。然后考察甲醇的用量(25 mL和50 mL)以及回流的時間(15 min、30 min、4 min和60 min)，結果使用25 mL和50 mL溶劑提取無顯著差異，回流30 min可達到3種成分的有效提取，因此提取條件選擇用25 mL甲醇回流提取30 min。

3.4 方法耐用性

實驗考察3種色譜柱[Agilent Eclipse Plus C18、Waters Atlantis?T3 C18、太瑋JADE-PAK?KP C18，規格均為(250 mm×4.6 mm，5 μm)]和4種不同柱溫(20 ℃、25℃、30 ℃和35 ℃)對樣品中各成分檢測的影響。結果Agilent C18柱在20 ℃、25 ℃、30 ℃，Waters C18柱在20 ℃、25 ℃、30 ℃，太瑋C18柱在20 ℃、25 ℃時，各成分與相鄰峰均達到基線分離，因此建議柱溫設定在20～25 ℃。

4 結語

從含量測定結果來看，15批次金烏骨通膠囊樣品中淫羊藿苷含量范圍為0.509～1.323 mg/g，平均值為0.720 mg/g；兩種補骨脂素總含量的范圍為0.930～1.588 mg/g，平均值為1.286 mg/g，以平均值下浮30%確定含量限度，建議本品每1 g含淫羊藿苷不得低于0.50 mg，含兩種補骨脂素的總量不得低于0.90 mg，15批次樣品測定結果均高于擬定的含量限度。本實驗建立的HPLC方法分離效果好，方法耐用，可應用于金烏骨通膠囊的質量控制。