金鈴子散治療附睪炎機(jī)制探討:基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

李嘉林，陳少明，黃銘鋒，劉永強(qiáng)，梁文康，孫傳濤

(廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院，廣東 廣州 511400)

附睪炎是男性生殖系統(tǒng)非特異性感染的常見病，見于各年齡段的男性，但多為20～40歲的青壯年，占所有患者的70%[1-2]。分為急性附睪炎和慢性附睪炎兩種類型，又以慢性型更為常見。主要臨床表現(xiàn)為腹下腹股溝指征痛、陰囊腫大、站立或行走時疼痛加重等[3]。此外，體格檢查可發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)、腫塊或變硬，伴有輕度或中度壓痛，病理方面也可發(fā)現(xiàn)輸精管擴(kuò)張[4]。附睪炎病因復(fù)雜多樣，但發(fā)病機(jī)制不同，通常被認(rèn)為是繼發(fā)于前列腺炎或尿路感染，該病可嚴(yán)重影響患者的心理健康和生活質(zhì)量[5]。同時，由于附睪內(nèi)不同程度的炎癥反應(yīng)，還可能減少精子的產(chǎn)生和發(fā)育，導(dǎo)致精子畸形明顯增加[6]。目前，對附睪炎的確切治療還沒有定論，抗生素和抗炎藥仍是主要治療方法[7]。但對于復(fù)發(fā)性慢性附睪炎，由于結(jié)節(jié)的易感性，藥物不易起效[8-9]。

近年來，中醫(yī)藥在臨床試驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用。研究表明，中藥在減輕附睪慢性疼痛、減輕陰囊腫脹、抗組織纖維化等方面具有明顯的療效。中藥中的一些特殊成分可以達(dá)到預(yù)期的外周鎮(zhèn)痛效果，主要是通過調(diào)節(jié)機(jī)體功能，促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性阿片肽的產(chǎn)生等[10]。此外，還可以通過增加炎性組織和血清中β-EP的水平發(fā)揮抗炎作用[11]。

金鈴子散首見于劉完素《素問病機(jī)氣宜保命集》，由川楝子和延胡索兩味藥物組成，方中川楝子行氣解郁、苦寒泄熱，為君藥；延胡索活血化瘀、辛溫散行，為臣藥。行氣以帥血，氣行則血活，二藥相配，共奏行氣活血、瀉熱止痛之效，是治療肝郁化火而致的胸脅、腹脘、疝氣痛、痛經(jīng)等痛癥的代表方劑[12-13]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，金鈴子散水煎液具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用[14]，且復(fù)方制劑鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于單藥[15],我院在多年臨證治療過程中，常用金鈴子散化裁方治療急慢性附睪炎，臨床效果顯著，但目前對于該方劑治療附睪炎的機(jī)理研究相對較少，整體性機(jī)制的研究有待提高，給該方劑的臨床推廣帶來了障礙。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種綜合系統(tǒng)方法、計算方法和實(shí)驗(yàn)方法來闡明藥物分子機(jī)制的研究方法[17]，可以多組分、多靶點(diǎn)地將藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與生物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，更加系統(tǒng)全面地研究藥物的作用機(jī)制。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對金鈴子散治療慢性附睪炎的成分及靶點(diǎn)進(jìn)行歸納整理，通過藥物與疾病靶點(diǎn)的融合，進(jìn)而篩選出核心靶點(diǎn)，探討其治療疾病的作用機(jī)制，為探索中藥方劑金鈴子散治療附睪炎的機(jī)制提供新的思路，為中醫(yī)療法治療疾病尋找新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 金鈴子散活性成分篩選

通過計算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室平臺(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，分別檢索川楝子和延胡索的化學(xué)成分，其中川楝子33個、延胡索49個。本研究結(jié)合藥代動力學(xué)的吸收、分布、代謝、排泄(ADME)，以“口服吸收利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18”作為活性成分的篩選條件，并通過文獻(xiàn)檢索補(bǔ)充篩選條件之外的有效活性成分。

1.2 活性成分靶點(diǎn)預(yù)測

基于所篩選的化學(xué)成分，通過以下2種方式預(yù)測相關(guān)靶點(diǎn)：①通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢靶點(diǎn)蛋白名稱；②從PubChem數(shù)據(jù)庫檢索成分相關(guān)Canonical SMILES，從SwissTargetPrediction預(yù)測相關(guān)靶點(diǎn)。作為一個在線網(wǎng)絡(luò)工具，SwissTargetPrediction基于相似原理，通過反向篩選預(yù)測小分子最可能的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。最后通過Uniport數(shù)據(jù)庫將成分所對應(yīng)的蛋白名稱轉(zhuǎn)化為基因名，限定物種為“human”，從而獲取成分相應(yīng)靶點(diǎn)。

1.3 附睪炎疾病靶點(diǎn)整理

以附睪炎(Epididymitis)為關(guān)鍵詞，從DisGeNET和GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索疾病相關(guān)的靶點(diǎn)。DisGeNET是一個綜合性的發(fā)現(xiàn)平臺，其包含超過380 000個基因和13 000種疾病之間的關(guān)聯(lián)，旨在解決與人類疾病的遺傳基礎(chǔ)有關(guān)的各種問題。此外，該平臺涵蓋孟德爾和復(fù)雜疾病的信息，并包含來自動物疾病模型的數(shù)據(jù)。它的特點(diǎn)是基于支持性證據(jù)的評分，以確定基因與疾病關(guān)聯(lián)的優(yōu)先順序。GeneCards數(shù)據(jù)庫作為一個開放的網(wǎng)絡(luò)資源，它提供的信息旨在深入了解有關(guān)基因的現(xiàn)有知識，包括關(guān)注其在健康和疾病中的功能，包括了SWISS-PROT、OMIM、Genatlas和GDB數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，使用GeneCards數(shù)據(jù)庫可以快速獲取有關(guān)基因集功能的信息。最后將靶點(diǎn)基因?qū)險niProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化后整理歸納。

1.4 潛在作用靶點(diǎn)篩選和蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

應(yīng)用Cytoscape 3.2.1軟件將成分和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，取其交集部分作為金鈴子散治療附睪炎的潛在治療靶點(diǎn)。為了更好了解這些潛在靶點(diǎn)的治療效果，應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫對潛在靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系進(jìn)行研究，獲得蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系(Protein-protein interaction，PPI)。STRING數(shù)據(jù)庫旨在為盡可能對已知和預(yù)測的關(guān)聯(lián)進(jìn)行評分和整合，形成覆蓋超過1 100個生物體的綜合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

網(wǎng)絡(luò)是各種連接節(jié)點(diǎn)和邊的計算良好的數(shù)學(xué)模型。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的一個重要組成部分是網(wǎng)絡(luò)分析，主要包括屬性分析、拓?fù)浞治觥⒕W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性分析。網(wǎng)絡(luò)分析通常測量模塊、介數(shù)、關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)、邊、最短路徑和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的自由度。本研究中網(wǎng)絡(luò)圖均應(yīng)用Cytoscape 3.2.1軟件，對生物網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化探索和分析。并應(yīng)用Cytoscape構(gòu)建：①中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖；②中藥-成分-交集靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖；③核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖；④中藥-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。此外，利用Cytoscape 3.2.1中“Network Analyzer”功能對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，以獲得自由度(Degree)等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，并分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的重要性。

1.6 潛在靶點(diǎn)功能富集分析與通路分析

為了進(jìn)一步了解這些核心靶點(diǎn)的功能，通過DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)生物學(xué)功能富集分析，獲取生物過程(Biological process，BP)、細(xì)胞成分(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)等分析結(jié)果(P<0.05)；同時，也獲得KEGG信號通路(P<0.05)富集分析結(jié)果。基于GO分析和KEGG分析探討“金鈴子散”治療附睪炎的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 金鈴子散活性成分篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)平臺，基于“ADME參數(shù)OB≥30%，DL≥0.18”條件初步篩選成分，得到金鈴子散中川楝子9個活性成分、延胡索49個活性成分。其中，共同的活性成分1個。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，川楝子中楝烷型三萜類化合物川楝素具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，對全身多系統(tǒng)功能具有良好的調(diào)節(jié)作用[16]，因此補(bǔ)充川楝素(toosendanin)作為活性成分。綜上所述，共得到金鈴子散中58個活性成分。見表1。

表1 金鈴子散活性成分信息

續(xù)表1

2.2 活性成分靶點(diǎn)預(yù)測

從TCMSP和SwissTargetPrediction預(yù)測得到成分相關(guān)靶點(diǎn)357個，其中Nimbolin D和melianone沒有相關(guān)靶點(diǎn)。通過Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”(圖1)。此網(wǎng)絡(luò)圖包括416個節(jié)點(diǎn)(2個單味藥節(jié)點(diǎn)、57個成分節(jié)點(diǎn)和357個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))、1 791條邊。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，槲皮素(quercetin)、豆甾醇(stigmasterol)和金黃紫堇堿((S)-Scoulerine)具有較高的自由度，自由度越大，參與的生物功能越多，在網(wǎng)絡(luò)中的重要性則越強(qiáng)。通過對以上成分的靶點(diǎn)進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)，PTGS2和PTGS1的度值最高，這提示大多成分的靶點(diǎn)主要與炎癥反應(yīng)相關(guān)，可以廣泛調(diào)控炎癥因子、趨化因子、黏附分子、血管生長因子等。因此，從成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中可以看出，金鈴子散對附睪炎的治療作用可能主要集中在對炎癥反應(yīng)的調(diào)控方面。

注:正方形代表成分；圓形代表靶點(diǎn)；菱形代表草藥。

2.3 疾病靶點(diǎn)收集和潛在作用靶點(diǎn)獲取

從DisGeNET和Gene Cards數(shù)據(jù)庫共搜集到955個靶點(diǎn)。利用Cytoscap 3.2.1中的Merged功能將成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行融合，得到88個交集靶點(diǎn)作為金鈴子散治療附睪炎的潛在治療靶點(diǎn)。應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建花椒-成分-候選靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。從網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出，川楝子與延胡索通過不同的成分作用于靶蛋白，進(jìn)一步發(fā)揮治療效果。因此，療效的取得是通過成分與靶點(diǎn)的層級作用實(shí)現(xiàn)的。

注：菱形代表草藥；正方形代表成分；圓形代表靶點(diǎn)；三角形代表疾病。

2.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步深入了解這些潛在候選靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫獲得蛋白與蛋白之間的相互關(guān)系。其中，88個潛在作用靶點(diǎn)有86個發(fā)生相互作用，將STRING數(shù)據(jù)導(dǎo)出，利用Cytoscape 3.2.1將蛋白之間的相互作用關(guān)系可視化(圖3)，此網(wǎng)絡(luò)圖包括86個節(jié)點(diǎn)、891條邊。通過對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯琁L6、TNF、TP53和CASP3等靶點(diǎn)具有較高的度值，提示這些靶點(diǎn)在疾病的治療過程中發(fā)揮著重要的作用。

注：圓形代表靶點(diǎn)。

2.5 基因本體論分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體論(GO)分析，共獲得874個分析條目；其中分子功能71個、生物過程772個、細(xì)胞組分31個(P<0.05)。按照富集分析P值進(jìn)行排序，分別列舉了排名前10位的富集分析結(jié)果(圖4)。基因本體論分析結(jié)果表明，在分子功能中，主要與類固醇激素受體(GO：0003707 steroid hormone receptor activity)、配體依賴性核受體活性(GO：0004879 ligand-dependent nuclear receptor activity)、脂質(zhì)結(jié)合(GO：0008289 lipid binding)和蛋白質(zhì)二聚體活性(GO：0046983 protein dimerization activity)等分子功能相關(guān)(圖5)；在生物過程中，主要涉及到細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)(GO：0042127 regulation of cell proliferation)、對有機(jī)物的反應(yīng)(GO：0010033 response to organic substance)和凋亡(GO：0042981regulation of apoptosis)等生物過程(圖6)；在細(xì)胞組成中，主要涉及到細(xì)胞外空間(GO：0005615 extracellular space)、胞外區(qū)部分(GO：0044421 extracellula region part)和神經(jīng)元投射(GO：0043005 neuron projection)等功能。

圖4 分子功能富集分析

圖5 生物過程富集分析

圖6 細(xì)胞組成富集分析

2.6 KEGG富集分析

通過DAVID在線分析平臺對潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)在86個核心靶點(diǎn)中，有52個參與到15條通路中。利用Cytoscape構(gòu)建通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖7)，此網(wǎng)絡(luò)圖包括66個節(jié)點(diǎn)和88條邊。對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治觯渲校琓NF、IL6、IL2、IL10、MTOR和IL1B等靶點(diǎn)具有較有較高的度值，富集排名度值靠前的通路主要有細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(hsa04060：Cytokine-cytokine cytokine receptor interaction)、鈣信號通路(hsa04020：Calcium signaling pathway)、Jak-STAT信號通路(hsa04630：Jak-STAT signaling pathway)和凋亡(hsa04210：Apoptosis)等信號通路。通路分析顯示信號通路及相關(guān)通路主要涉及到炎癥、凋亡等方面，故金鈴子散可能通過其有效活性成分作用于若干靶點(diǎn)，對多種信號通路產(chǎn)生進(jìn)一步調(diào)控作用，從而發(fā)揮治療附睪炎的作用。

注：“V”形代表通路，圓形代表靶點(diǎn)。

3 討論

本研究通過多個數(shù)據(jù)庫收集得到附睪炎的相關(guān)疾病靶點(diǎn)，提示附睪炎的發(fā)生可能是由多個靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺，基于藥代動力學(xué)ADME參數(shù)，以“OB≥30%，DL≥0.18”為篩選條件，選取川楝子和延胡索中生物活性較好的58種化學(xué)成分。此外，結(jié)合文獻(xiàn)檢索得到篩選條件之外的活性成分川楝子素。通過成分靶點(diǎn)預(yù)測和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析，篩選出86個潛在作用靶點(diǎn)用于進(jìn)一步分析。利用DAVID數(shù)據(jù)平臺得到GO分析結(jié)果三類，包括分子功能、細(xì)胞組分和生物過程，就其生物過程而言，主要涉及凋亡和增殖。此外，KEGG通路富集分析結(jié)果提示，金鈴子散主要涉及到炎癥、凋亡等方面。

在泌尿生殖系統(tǒng)中，先天免疫系統(tǒng)和雄性生殖道之間的相互作用對于雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育和維持至關(guān)重要。附睪是精子成熟、保護(hù)和貯存過程中起關(guān)鍵作用的黏膜器官，附睪內(nèi)的免疫環(huán)境必須緊密協(xié)調(diào)，以便迅速減輕可能危害成熟精子的致病威脅。這種環(huán)境還必須保持一個耐受性環(huán)境，以避免宿主免疫系統(tǒng)破壞自身抗原性精子[17]。盡管這些免疫機(jī)制對維持附睪內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要，但它們在很大程度上仍具有一定的未知性。了解附睪是如何感覺到并對入侵的細(xì)菌產(chǎn)生防御反應(yīng)的，這對臨床極為重要，因?yàn)榧?xì)菌感染是附睪炎最常見的病因，而附睪炎是男性生殖系統(tǒng)常見的炎癥性疾病[18]。因此，抗炎就是治療附睪炎的首要方略。

炎癥細(xì)胞因子與人體免疫系統(tǒng)抗炎成分之間存在著動態(tài)的、不斷變化的平衡。這些細(xì)胞因子和細(xì)胞因子抑制劑對炎癥的調(diào)節(jié)機(jī)制比較復(fù)雜，因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)有多余的途徑，而多個元素具有相似的生理效應(yīng)。此外，除了白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(il-1ra)之外，所有的抗炎細(xì)胞因子至少都具有一些促炎特性。任何細(xì)胞因子的凈效應(yīng)取決于細(xì)胞因子釋放的時間、作用的局部環(huán)境、競爭或協(xié)同元素的存在、細(xì)胞因子受體密度，以及組織對每種細(xì)胞因子的反應(yīng)等[19]。基因、環(huán)境或微生物因素對細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的干擾可能會產(chǎn)生非常有害的后果[20]。主要的抗炎細(xì)胞因子在附睪炎的治療過程中可能發(fā)揮著舉足輕重的作用。在通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中，TNF、IL6、IL2、IL10和IL1B等炎癥因子的度值較高，意味著這些炎癥因子在疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用。在全反式維甲酸(atRA)減輕附睪炎急性炎癥的機(jī)制研究中，通過構(gòu)建小鼠附睪炎模型，連續(xù)5天腹腔注射全反式維甲酸。結(jié)果表明，atRA通過降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，增加TGFβ1、Ⅱ-10等抗炎因子的表達(dá)，減輕了小鼠附睪炎的炎癥反應(yīng)。

此外，據(jù)研究報道，JAK激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號通路與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑和炎癥性腸病等炎癥性和自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)。許多參與自身免疫和炎癥性疾病發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞因子使用JAKs和STATs來傳遞細(xì)胞內(nèi)信號。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)挖掘和整合分析發(fā)現(xiàn)，JAK2/3和STAT1具有較高的度值，表明JAK-STAT信號通路在附睪炎的治療中也發(fā)揮著重要作用，不過由于相關(guān)研究較少，此項(xiàng)結(jié)果有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

MTOR是一種磷酸肌醇-3-激酶相關(guān)蛋白激酶，作為一種變阻器在哺乳動物體內(nèi)發(fā)揮作用，能夠以營養(yǎng)素、能量和生長因子的形式整合各種環(huán)境信號，以調(diào)節(jié)組織過程和內(nèi)穩(wěn)。此外，TP53作為一個凋亡相關(guān)的基因，本研究發(fā)現(xiàn)MTOR和TP53同樣作為治療靶點(diǎn)(圖8)，在金鈴子散治療附睪炎的過程中發(fā)揮著作用。然而，這些靶點(diǎn)與附睪炎的關(guān)系還需要深入研究。

圖8 金鈴子散治療附睪炎的作用機(jī)制

本研究通過數(shù)據(jù)挖掘，在大量計算機(jī)運(yùn)算法則的基礎(chǔ)上，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對金鈴子散的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果表明，其治療附睪炎具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。通過多種數(shù)據(jù)分析，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新的研究方法，可以極大提高工作效率，為未來中醫(yī)藥機(jī)制方面的研究提供了重要參考。