脫細胞基質(zhì)在軟骨及骨組織工程中的應用研究進展

田臻,林科夫,黃奇,高峰,萬莎,李浪

(西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院,四川 成都 610041)

組織工程技術(shù)能夠通過再生修復重建受損組織的結(jié)構(gòu)和功能，因此得到廣泛關注與研究。而通過組織工程技術(shù)實現(xiàn)此過程的前提是適合的支架材料。脫細胞基質(zhì)(AM)是指經(jīng)特殊處理以除去組織中細胞成分，制備成無活體細胞存在的細胞外基質(zhì)(ECM)成分和結(jié)構(gòu)的生物支架。此支架具有優(yōu)良的生物相容性，保留了生物活性且無免疫排斥反應，被越來越多地應用到組織工程中[1]。至今AM已被應用于多種組織和器官的臨床重建，如軟骨、膀胱[2]和心臟[3]等。本文就脫細胞軟骨基質(zhì)(ACM)的概述、制作技術(shù)、支架力學性能以及在軟骨與骨組織工程中的應用進行綜述。

1 ACM的概述

脫細胞的生物基質(zhì)材料被認為是一類極具前景的生物材料，這些經(jīng)過脫細胞處理的基質(zhì)含有部分的天然ECM成分和結(jié)構(gòu)，為細胞的黏附、生長和增殖提供了良好的微環(huán)境；此外，ACM植入體內(nèi)后很容易被降解和吸收[4]。目前有許多脫細胞的基質(zhì)材料用于組織工程研究中，部分已用于臨床，并取得了較好的臨床效果。例如：皮膚、心包、血管、膀胱等AM[5]。

軟骨基質(zhì)由于其自身的結(jié)構(gòu)特殊性及免疫原性，目前還沒有被批準用于臨床，有學者按其來源將軟骨基質(zhì)分為兩類[6]：①天然軟骨基質(zhì)，如關節(jié)軟骨、耳軟骨、鼻軟骨等；②軟骨細胞分泌的ECM，這些基質(zhì)可能缺乏某些天然基質(zhì)的成分，其密度多低于天然組織。天然軟骨基質(zhì)用于軟骨組織工程具有以下優(yōu)點：①軟骨來源廣泛、獲取方便，重塑能力良好，異種及異體皆可；②其成分更接近待修復的軟骨組織，具有良好的生物相容性[7]。基于以上優(yōu)點使得天然軟骨基質(zhì)成為目前軟骨組織工程的一大研究熱點，同時軟骨基質(zhì)具有潛在的臨床應用可能性。

2 ACM的制作技術(shù)進展

天然軟骨內(nèi)的軟骨細胞是免疫抗原的主要成分，因此脫去軟骨細胞及其相關的DNA等物質(zhì)是獲得支架材料的重點。但天然軟骨結(jié)構(gòu)致密，直接脫細胞效果不佳，目前常采用的脫細胞方法有：①物理方法[8]，用液氮反復凍融導致細胞內(nèi)形成冰晶，破壞細胞膜和細胞核，但不能完全消除細胞DNA，DNA的殘留可能引發(fā)強烈的免疫原性反應；②脫細胞化處理，一般采用物理和化學相結(jié)合的方法去除基質(zhì)內(nèi)所有細胞及其組分如DNA和RNA[9]。軟骨脫細胞可采用軟骨片和軟骨微粒兩種形態(tài)：①軟骨片方式，將軟骨片經(jīng)反復凍融后產(chǎn)生裂隙，加入化學試劑，試劑通過裂隙達到脫細胞的目的，但該方法脫細胞的效果有待進一步考證[10]；②軟骨微粒方式，較常用的方法是將軟骨片經(jīng)反復凍融、冷凍硬化后再研磨成軟骨微粒，從而破壞軟骨的天然大分子結(jié)構(gòu)，有效暴露軟骨基質(zhì)，再使用化學試劑破壞細胞并將其清除，該方法脫細胞較徹底，但由于軟骨結(jié)構(gòu)的破壞，大大降低了軟骨基質(zhì)的機械強度。因此，尋求脫細胞效果和維持機械強度之間的平衡是制作ACM的研究方向。

目前常用的脫細胞化學試劑包括：三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙二醇衍生物(Triton X-100)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和月桂基硫酸鈉(SLS)。SDS和SLS能破壞蛋白之間的連接從而去除細胞[11]；Tris-HCl作為核酸和蛋白質(zhì)的溶劑，可以溶解軟骨片的血污及油污[12]；Triton X-100是一種非離子洗滌劑，可破壞DNA蛋白、脂質(zhì)和脂質(zhì)蛋白相互作用[13]；EDTA用作洗滌劑、血液抗凝劑[14]。常用的脫細胞酶包括核酸酶和胰蛋白酶，特別是DNaseⅠ，可以消除分散的核碎片，減少DNA；胰蛋白酶能破壞膠原纖維周圍的ECM，產(chǎn)生微小的通道，并促進隨后脫細胞劑的滲透[15]。目前國內(nèi)外文獻中已介紹了多種脫細胞方法，大部分都是以上各個試劑的組合及拓展。

YANG等[9]報道了一種軟骨去細胞化的方法，首先將軟骨切片浸入液氮中，冷凍干燥后，將樣品研磨成粉末，然后用胰蛋白酶和核酸酶處理軟骨粉，再用Triton X-100去細胞化，從而獲得脫細胞的軟骨基質(zhì)。但是，研磨導致了軟骨的天然結(jié)構(gòu)破壞，ECM沒得到較好地保存。后來BENDERS等[16]改進了該方法，他們將軟骨片在液氮中快速冷凍，在37 ℃下進行 6 次胰蛋白酶-EDTA處理，核酸酶溶液處理后放入Triton X-100中浸泡從而獲得脫細胞支架，該支架保留了大多數(shù)的Ⅱ型膠原，可以促進間充質(zhì)干細胞(MSCs)的軟骨分化。然而，定量二甲基亞甲基藍(DMMB)分析結(jié)果顯示，胰蛋白酶處理后的支架會丟失大量糖胺聚糖(GAG)。TAVASSOLI等[17]將物理方法和化學方法結(jié)合，組織先在 -4 ℃保存1周，在液氮中進行 5 次凍融循環(huán)，最后用25 g/L的 SDS 處理1、4 和 8 h，這種方法保存了大量的GAG和膠原。 另外，有學者調(diào)節(jié)部分脫細胞試劑后顯示能夠保留更好的ACM支架的力學性能[18]。ZHANG等[19]將軟骨片用10 mmol/L含有苯基磺酰氟的Tris-HCl浸泡24 h，然后在含體積分數(shù)0.01的 Triton X-100 的 Tris-HCl中浸泡 48 h，最后用2 000 U/L的 DNAse化鹽水溶液處理 12 h，以去除DNA殘留，該脫細胞過程去除了 90% 的DNA，但保留了82.4%的CAG和 82.8% 的膠原。

多項研究提出可用去污劑-酶法去除細胞[20-21]，該方法運用去污劑-酶法結(jié)合傳統(tǒng)的物理方法如凍干、照射法，脫去軟骨基質(zhì)中的細胞成分(如DNA、RNA等)，保留ECM材料(如彈性蛋白、膠原等)。通過多次使用去污劑及酶對細胞成分進行處理，將其脫出或破壞，從而達到充分去除軟骨細胞表面的組織相容性抗原[22]。

但是前文提及的所有試劑均有毒性，因此脫細胞后還需要長時間的浸泡以去除殘留在支架內(nèi)的毒性試劑[23]。另外，反復的脫細胞操作后軟骨基質(zhì)的主要成分Ⅱ型膠原和GAG含量會下降，基質(zhì)的生物力學性能也有不同程度的降低。因此，如何將ACM改性，提高其力學性能從而進一步應用于負重組織的修復[24]，是目前軟骨組織工程研究的另一個熱點。

3 ACM支架力學性能的增強方式

目前提高支架力學性能的方法有兩種[25]：第1種是尋求更有效的交聯(lián)方法；第2種是結(jié)合其他的材料的特性，與ACM優(yōu)勢互補，從而達到改性的目的。

有研究者采用二氧化碳激光技術(shù)對豬的脫細胞關節(jié)軟骨基質(zhì)支架(CMS)表面進行改性，通過優(yōu)化激光參數(shù)，在軟骨支架表面引入了大小適宜、呈晶格狀排列的錐形微孔。研究結(jié)果顯示，激光修飾的 CMS可以提高脫細胞支架的楊氏模量，有利于細胞黏附[26]。VISSER等[27]用甲基丙烯酰胺與脫軟骨細胞基質(zhì)水凝膠進行光反應成膠，研究結(jié)果顯示，壓縮彈性模量為 70 kPa。GARRIGUES等[28]為加強支架的納米級結(jié)構(gòu)，采用靜電紡絲技術(shù)制備單層及多層的電紡聚ε-己內(nèi)酯(PCL)-ACM支架，多層PCL-ACM支架的孔徑最小為(0.90±0.15) mm，但壓縮彈性模量僅為10 kPa。

PINHEIRO等[29]分別用4種交聯(lián)劑(分別是京尼平、戊二醛、葡萄籽原花青素和沒食子酸)對ACM進行化學交聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有京尼平、戊二醛交聯(lián)后的支架材料的孔徑?jīng)]有明顯改變，其中戊二醛幾乎對支架的孔徑?jīng)]有影響，他們認為戊二醛可以作為一種有效的ACM交聯(lián)劑，可以替代其他的交聯(lián)劑。WANG等[30]利用“液相共合成”技術(shù)，將礦化關節(jié)軟骨ACM和納米相(HAP)脫細胞軟骨ECM(ACECM-HAP)懸浮液、純ACECM懸浮液分別制備集成雙層支架。結(jié)果顯示，支架孔徑從(21.2±3.1)到(128.2±20.3) μm不等。隨著HAP的比例加大，復合材料的力學性能逐漸增強，當HAP/ACECM比值為70 g/L時復合材料最接近天然的鈣化軟骨。BECK 等[31]在ACM水凝膠中加入甲基丙烯酸酯，并用紫外線進行交聯(lián)獲得甲基丙烯酸可溶性脫細胞軟骨凝膠(MESDCC)，MESDCC支架力學性能良好，彈性模量高達(1 070±150) kPa，完全達到正常軟骨的要求。

GONG等[32]應用世界上最薄的材料氧化石墨烯(GO)對3D-ACM進行修飾改性(GO能夠改善支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，提高支架的機械強度)，修飾后的復合支架在體外可促進細胞黏附、細胞增殖和軟骨分化，并且復合支架具有良好的生物相容性。實驗結(jié)果表明，GO修飾的3D-ACM復合支架可以滿足軟骨修復支架的力學和生物學要求，這項研究能為軟骨組織工程和臨床轉(zhuǎn)化的研究提供參考。

因此，尋求一種化學和物理的混合交聯(lián)的方法可能是提高ACM支架力學性能的一個研究方向。

4 ACM在軟骨及骨組織工程中的應用

ACM的某些成分接近天然軟骨，如葡萄糖胺聚糖、膠原蛋白等，將其用在軟骨組織工程中具有得天獨厚的優(yōu)勢[33]。國內(nèi)外不少的科研團體對此做過一些探索，主要集中在兩個方面。①將ACM制作成可注射懸漿，用于骨關節(jié)炎模型或骨缺損模型的修復。張亞鑫[34]制備了脫細胞軟骨基質(zhì)顆粒，體外實驗及電鏡觀察證實其具有良好的生物學特性及力學結(jié)構(gòu)，將含該顆粒的懸漿注射入新西蘭兔的膝關節(jié)，修復膝骨關節(jié)炎模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)負重區(qū)軟骨侵蝕明顯減少，磨損區(qū)有透明樣軟骨生成。②將ACM制作成三維支架，植入體內(nèi)修復臨界軟骨缺損[35]。吳軍成等[36]用脫細胞耳軟骨(DC)與磷酸三鈣人工骨(β-TCP)制作成圓柱狀的β-TCP-DC生物復合支架，支架負載經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)誘導成的軟骨細胞，同時加入轉(zhuǎn)化生長因子-β、胰島素樣生長因子1修復兔的關節(jié)軟骨缺損，20周后實驗組缺損內(nèi)透明軟骨生長，與周圍正常軟骨連接良好。LI等[29]用兔軟骨細胞接種CMS，體外培養(yǎng)8周后在支架的表面及微孔內(nèi)發(fā)現(xiàn)軟骨樣組織，而植入裸鼠體內(nèi)的支架也發(fā)現(xiàn)了乳白色軟骨組織，修復兔的膝關節(jié)缺損結(jié)果滿意。因此，激光加工微孔后的脫細胞異種CMS是一種可用于關節(jié)軟骨的修復的支架。PARK等[37]用3周齡的豬軟骨經(jīng)過處理后制作成ACM膜，將提取的新西蘭兔關節(jié)軟骨細胞種植在膜上，發(fā)現(xiàn)細胞的活力和增殖量與在標準培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的相似；另外將2×105、4×105和6×105/cm2等3個密度的軟骨細胞種植在膜上，顯示ACM膜可以承受不同密度的細胞生長；復合細胞的材料種植在裸鼠皮下4周即發(fā)現(xiàn)了新生軟骨，下一步他們將應用于軟骨缺損的修復。ZHANG等[38]提取人臍帶沃頓果凍間充質(zhì)干細胞(hWJMSCs)，將hWJMSCs接種于ACECM導向支架中，構(gòu)建細胞支架復合物，用于修復6只山羊股骨髁關節(jié)軟骨的全層缺損。實驗分為細胞支架復合物組(實驗組)和微骨折組(空白組)，結(jié)果顯示，2周和4周時兩組的免疫炎癥參數(shù)比較無明顯差異，MRI顯示實驗組具有更好的透明軟骨再生，組織學評估顯示實驗組的軟骨缺損處Ⅱ型膠原含量更高。

ACM還有不少應用于骨軟骨修復方面探索。WANG等[30]將兔的軟骨細胞接種在支架表面后發(fā)現(xiàn)，細胞呈低滲透性、僅停留在材料的表層，提示支架具有較高的細胞性和豐富的基質(zhì)沉積，可以作為一種骨軟骨修復的候選材料。ZHANG等[19]取兔的膝關節(jié)股骨髁軟骨在脫細胞后制備脫細胞骨軟骨基質(zhì)片，取P3代的脂肪干細胞接種在材料上修復兔的膝關節(jié)股骨髁軟骨缺損，組織學結(jié)果顯示細胞材料組具有更好的界面整合、軟骨再生和膠原纖維排列，類似于天然結(jié)構(gòu)，且再生和整合區(qū)的GAG和膠原積累顯著增加；基因表達分析表明，ACM軟骨片形成的相關軟骨mRNA表達水平顯著升高，與組織學結(jié)果一致。ACM由于保留了大部分軟骨基質(zhì)的成分，該研究也利用3D-ACM分別復合人尿源性干細胞(hUSCs)和hBMSCs修復軟骨缺損，結(jié)果顯示都能有效地修復軟骨，兩種細胞沒有明顯的統(tǒng)計學差異。

5 小結(jié)與展望

ACM是一類極具應用前景的生物材料，如今軟骨組織工程對ACM的制備及改性研究已經(jīng)取得了長足進步，為軟骨缺損的修復提供了新的方式。但是由于軟骨的特殊結(jié)構(gòu)，使用組織工程技術(shù)修復軟骨仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)，這些新的軟骨修復措施都需要采用穩(wěn)健的方法進行臨床試驗，以評估它們在臨床應用中的療效和安全性[39]。因此，對材料的改性以增強其力學性能仍然是今后的重點研究方向。相信未來ACM可以成為一種成熟的臨床廣泛應用的組織材料。