中藥調控膝骨關節炎細胞自噬實驗研究進展

岳百川 李盛華 盧冠錦 李 毅

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

膝關節骨性關節炎(osteoarthritis of the knee，KOA)是一種以膝關節疼痛、活動受限甚至功能喪失為臨床表現，嚴重影響中老年人群生活質量和心理健康的慢性退行性疾病，臨床病理學表現為關節軟骨退變、骨質增生硬化和滑膜炎癥[1-2]。KOA是發病率較高的骨關節退行性疾病之一，自20世紀中葉以來，膝骨關節炎的患病率已經翻倍[3]。王斌等[4]通過Meta分析，得出我國KOA患病率為18%。隨著KOA患病率的逐年升高，人工膝關節置換術這一膝骨關節炎的終極治療措施的應用也越來越成熟，但是該手術所帶來的經濟負擔不容忽視。2019年澳大利亞骨科學會預測到2030年全膝關節置換術(total knell replacement，TKR)發生率將增加276%，與全髖關節置換術(total hip replacement,THR)共造成53.2億澳元的醫療保健系統的成本壓力[5]。此外，由于受到長期慢性疼痛和活動受限甚至是殘疾的困擾，KOA患者更容易合并出現焦慮、抑郁等心理問題[6-7]。因此，對KOA的早期干預以減緩病情進展，提高患者的生活質量尤為重要。近年來，人們對自噬在KOA的發生發展過程中的作用進行了深入的研究。中藥復方具有多組分、多途徑、多靶點的特點，在膝骨關節炎的防治中可以起到網絡化調控的作用。可以調控自噬相關基因和信號通路，影響相關蛋白的表達，對早中期KOA的治療具有獨特作用。

1 自噬相關概述

自噬是細胞死亡的生物學途徑之一，對維持組織和機體內平衡起基礎性作用[8-12]。當自噬受到抑制時會導致細胞死亡[13]，自噬抑制狀態參與多種運動系統疾患的發病過程[14-15]。自噬過程大致可以分為自噬啟動、自噬體成核、自噬小體的形成和延伸、自噬體-溶酶體融合、自噬溶酶體降解五個階段[16-17]。自噬發揮著維持營養物質循環和代謝的重要生物學功能[18]，營養缺乏是自噬的主要啟動因素，缺氧和輻射等在自噬啟動中的作用也不容忽視[19]。雷帕霉素靶標(mammalian target of rapamycin,mTOR)是調控自噬的核心環節，其生物活性受PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路和AMPK信號通路和自噬相關蛋白(autophagy related protein,ATG)的調控[20]。自噬相關蛋白(ATG)在自噬過程中發揮著重要調控作用，目前已知的自噬相關蛋白有30余種[21]。PI3K/AKT/mTOR信號通路和AMPK/mTOR信號通路均與ATG1/ULK1相關，并控制磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P)的產生[22-23]。而PI3P在自噬形成過程中起關鍵作用[24]，可以刺激WIPI2的募集，并加速LC3的脂化[25]。LC3/ATG8家族蛋白脂化后參與子自噬體、自噬溶酶體形成等環節，是自噬的標志[26]。轉化生長因子β1(transforming grawth factor β1，TGF-β1)過度表達可以降低自噬相關蛋白LC3-II/I的比例，從而抑制自噬[27]。Deng等[28]通過制作KOA動物模型，并向其膝關節內注射氯沙坦，達到過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)表達上調的效果，同時通過滅活TGF-β1信號通路，有效抑制炎癥反應。以前認為ATG4蛋白僅參與LC3/ATG8的結合和解離，最新研究[29]表明ATG4家族蛋白存在獨立于LC3/GABARAP的脂化系統，即通過募集含有ATG9A的囊泡促進吞噬細胞的擴大。Beclin1是自噬的主要調節因子，是Ⅲ類PI3K復合物的核心成分[30]。新的研究[31]表明VCP/p97可以間接穩定Beclin蛋白水平，當VCP活性受到抑制時會導致PI3P產生減少和早期自噬標志物WIPI2和ATG16L1的募集減少。

2 KOA與自噬

軟骨退變是KOA最主要的臨床病理學特征。隨著年齡的增長和OA的進展，軟骨中存在軟骨陷窩和細胞減少，提示軟骨細胞發生死亡并參與了OA的發展[32]。自噬障礙和線粒體受損會下調軟骨細胞的活性[33]，激活自噬可以有效減少軟骨細胞的凋亡[34]。自噬和內質網應激互為上游，共同調控細胞死亡及維持細胞穩態[13]。而當自噬受到抑制的時會促進內質網應激加劇軟骨細胞凋亡及疾病進展[35]。隨著軟骨的逐漸退化，自噬水平也會隨之降低[36]，形成惡性循環。吳獻毅[37]的研究發現Beclin1、LC3A、ULK1在KOA患者關節軟骨中高表達，表明自噬參與KOA的發病與修復過程。

3 中藥復方及單方調控KOA自噬水平

中醫學認為，膝骨關節炎的中醫證型主要有氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、濕熱痹阻證、肝腎虧虛證和氣血虛弱證五個證型[1-2]，西醫學研究表明KOA的發病與衰老密切相關，故而肝腎虧虛、筋骨失養是KOA發病的基本病機。臨床辨證論治中補益肝腎、強筋壯骨類中藥在大多數KOA患者中均應酌情使用。研究發現右歸丸、四妙散、補腎活血方、補腎強筋膠囊、消腫止痛合劑等中藥復方在調控膝骨關節炎細胞自噬水平方面具有一定優勢[38-42]。顏春魯等[38]通過右歸丸干預KOA模型大鼠，發現中藥組大鼠軟骨組織中PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表達明顯降低，Beclin1的蛋白表達明顯升高，說明右歸丸提高軟骨細胞的自噬水平可能是通過抑制PI3K、pAkt和pmTOR和增強Beclin1的表達來實現。沈金明等[39]的研究發現四妙散能顯著升高LC3的表達，并導致軟骨凋亡相關蛋白Fadd、Casp3低表達，說明四妙散科通過FADD-CASP3途徑激活軟骨細胞自噬，控制KOA的進展。盧巖巖[40]通過用補腎活血方干預KOA模型大鼠，發現補腎活血方能使ULK1、Beclinl、LC3B、AMPK高表達，說明補腎活血方可能通過激活自噬AMPK/ULK1信號通路，抑制mTOR的表達，發揮保護軟骨的作用。彭莎等[41]的研究發現補腎強筋膠囊可以提高KOA模型組大鼠軟骨組織中Beclin1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、ULK1 mRNA和蛋白表達，并顯著降低p-mTOR蛋白表達量，認為補腎強筋膠囊可能通過AMPK/mTOR信號通路上調KOA軟骨細胞自噬。李金鵬等[42]通過運用消腫止痛合劑干預KOA模型大鼠，發現消腫止痛合劑在降低IL-6、MMP-3、COX-2、caspase-9、mTOR表達，上調LC3、Beclin1、p-AMPK的表達量方面優于硫酸氨基葡萄糖，說明消腫止痛合劑可以通過AMPK/mTOR信號通路上調軟骨細胞的自噬水平，從而促進KOA軟骨的修復。錢哲[43]運用網絡藥理學方法，發現“肝腎同治”組方調節細胞自噬是治療KOA的途徑之一。林志東等[44]的研究發現鹿茸可以上調細胞自噬基因的表達，同時下調細胞凋亡基因的表達，說明鹿茸科可通過細胞自噬、細胞凋亡清除受損的細胞器和蛋白質，起到維持細胞內環境穩態，保護關節軟骨的作用。

雖然目前在中藥干預KOA軟骨自噬方面進行了較多的研究，但是受限于中藥復方成分復雜的原因導致對于機制的深入研究較為困難，也不能排除中藥通過其他途徑干預軟骨細胞自噬，仍然需要進一步創新中醫藥研究方法。

4 中藥單體調控KOA自噬水平

隨著生物信息學尤其是網絡藥理學的發展，為人們通過已發表文獻中篩選中藥有效成分和靶點信息提供了便捷的途徑。中藥單體以其成分單一、便于研究的特點被大量應用于KOA防治的基礎研究和臨床研究。研究[45-46]表明，淫羊藿苷能顯著上調Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ULK1、FIP200、ATG13蛋白的表達進而影響自噬水平。青藤堿是一種主要存在于中藥青風藤的生物堿，具有抗炎鎮痛等多種生物學作用[47]。鄭潔等[48]觀察不同劑量的青藤堿干預KOA兔關節軟骨自噬水平，發現青藤堿能顯著下調關節軟骨中Atg-5、Atg-12的mRNA表達和Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達，同時發現青藤堿能顯著上調PI3K/akt/mTOR信號通路中PI3K、akt和mTOR的表達，說明青藤堿通過抑制PI3K/akt/mTOR信號通路，上調KOA兔關節軟骨自噬水平。商連斌等[49]通過檢測續斷總皂苷干預的KOA模型大鼠，發現續斷總皂苷組大鼠軟骨組織中p-PI3K、P-akt、p-mTOR的表達水平顯著降低，鏡下觀察發現該組大鼠軟骨病理損傷較輕，說明續斷總皂苷可抑制PI3K/akt/mTOR信號通路，上調軟骨細胞自噬水平保護關節軟骨；另一項研究[50]通過檢測續斷總皂苷干預KOA模型大鼠軟骨組織中Atg3、Atg4、Atg7表達水平，發現三者均顯著降低，進一步證實了續斷總皂苷可以激活軟骨細胞自噬保護關節軟骨。

5 小結與展望

自噬是維持關節軟骨細胞穩態的重要生物學機制之一，自噬活性降低則不能及時清除受損的細胞器和蛋白質，導致軟骨修復缺乏必要的物質基礎和能量，使軟骨細胞減少，最終軟骨退變。

目前尚未開發出調控軟骨自噬扭轉KOA進展的藥物，中醫藥具有多成分、多靶點等優勢。辨證用藥是中醫藥創新發展的核心，今后的研究中既不能放棄中藥復方網絡化調節的優勢，又要借助中藥單體的研究幫助明確其作用機制。未來應該堅持創新中醫藥科研方法，讓現代分子生物學理論更好地契合中醫藥理論。充分發揮中藥尤其是中藥復方干預KOA軟骨自噬的優勢，以期為中醫藥防治KOA提供理論依據和研究方向。