組織工程在先天性心臟瓣膜病外科治療領域中的應用

竇錚綜述，李守軍審校

先天性心臟病（先心病）種類復雜，病種繁多，其外科治療往往離不開瓣膜、補片、外管道等人工材料的植入，其中以瓣膜病為甚。隨著醫療技術的進步，外科人工植入物也經歷了一代代更迭，但或多或少都存在缺陷，即使目前臨床上更受青睞的生物瓣，也面臨瓣膜退化，耐久性差等問題，使其在臨床應用過程中受到一定限制[1]。對兒科患者而言，最大的問題莫過于兒童的生長發育導致的心內結構變化，導致人工瓣膜-患者不匹配，并可能引起術后患兒心功能減低、心室重構等嚴重并發癥[2]。上世紀80 年代，美國Joseph Vacanti 和Robert Langer提出了嘗試人工制造人類器官以應對器官移植物短缺的設想，并最終發展成為今天的組織工程學（TE）[3-4]。目前人類對組織工程的設想，是在解決現有移植物面臨的抗凝、衰敗、炎癥反應等問題的基礎上，使組織工程移植物植入人體后具有一定的生長發育潛能。盡管這一設想在臨床階段尚未完全實現，但組織工程在動物實驗中得到的積極成果及其在兒科領域的發展潛力，依舊吸引著眾多科研工作者投入其中。本文收集了目前組織工程在先心病瓣膜外科領域的臨床應用成功實例，并進行匯總，以期對組織工程在先心病領域的研究提供指導，并為小兒心臟外科醫師提供一定的臨床參考。

1 組織工程技術簡介

根據細胞定植發生部位的不同，組織工程可以分為：體外組織工程、體內組織工程和原位組織工程。

1.1 體外組織工程

體外組織工程也是最早提出的組織工程范例。簡單來說是將一部分體外培養的種子細胞，植入預先處理好的可吸收細胞支架，輔以細胞因子等，在體外生物反應器模擬的生理條件下進行增殖（細胞化）后植入人體[5]。在人體中，細胞支架逐漸被分解吸收，當植入細胞的增殖速度＞細胞支架的分解速度時，移植物便表現出穩定的自我生長趨勢。在支架中原有基質與細胞因子的共同作用下，種子細胞會逐步增殖為新的具有相應形態和功能的目標組織、器官，從而達到治療目的。但體外組織工程所需前期試驗較為復雜，如何選取合適的細胞與材料一直困擾著科研人員。

目前具有臨床意義的組織工程瓣膜主要聚焦于對可吸收細胞支架的研究。組織工程發展過程中，支架材料經歷了從同種和異種供體瓣膜到天然聚合物、合成生物可降解聚合物和雜化支架等技術進展[6]。脫細胞技術是生物來源組織工程細胞支架的基礎，即用酶、洗滌劑等除去組織中的細胞，保留細胞外基質及其幾何結構，形成具有細胞空隙的三維支架。但同種異體瓣來源不穩定，異種瓣膜在兒科中的免疫原性問題尚未解決[3]。新一代可生物降解的合成材料/天然聚合物材料可用于替代脫細胞生物瓣膜，如聚乙二醇、聚己內酯等，然而聚合物支架生物強度和耐久性雖好，其降解產物所引起的局部炎癥反應依舊限制了其臨床應用[7]。當下，新型的3D 打印支架逐漸進入人們的視野，該技術通常選取生物-聚合物水凝膠作為支架材料，種子細胞附著于3D支架上，可進行生長、增殖。2017 年，Bracaglia 等[8]報道了一種由聚乙二醇二丙烯酸酯與脫細胞牛心包基質勻漿交聯的水凝膠制成的生物-聚合物雜化支架，并證實了二者交聯可以提高雜化支架的壓縮模量，機械強度良好，在組織工程尤其是兒科領域移植物的開發中具有重要潛力。

1.2 體內組織工程

體內組織工程也稱活體組織工程，是將不可吸收的模具植入人體非病變部位（一般為皮下），利用人體自身的炎癥反應，使纖維組織包裹模具，一段時間后取出，剔除模具，回收纖維組織用于移植物制備。相較于其他兩種方法，體內組織工程不需要復雜的實驗室步驟以及漫長的制備時間，取材相對不受倫理學限制，但由于制備過程全程位于體內，可控性相對較差，且如何誘導形成心內組織，尤其是瓣膜的復雜多層結構，成為了限制其應用的最大因素[9]。

1.3 原位組織工程

將脫細胞的細胞支架直接植入患者體內（通常是待修補的部位），利用患者自身的循環系統充當生物反應器。原位組織工程的流程簡單、成本較低，相較于傳統體外生物反應器，再細胞化發生在患者體內，于生理條件下的血氧飽和度、血壓和剪切力等條件下進行，有利于組織的生長、增殖。然而，原位組織工程相應的難度也更大，血栓并發癥常見。且如何在體內控制支架的再細胞化是該技術最大的挑戰[7]。目前有研究人員嘗試用靜電紡絲制作原位組織工程瓣膜微孔支架，并在羊肺動脈瓣植入的12個月隨訪中獲得了較為理想的結果[10]，在兒科組織工程瓣膜應用方向表現出優秀的潛力，但仍缺乏相應的臨床數據支持。

2 不同移植物的臨床應用進展

2.1 組織工程瓣膜

目前臨床常用的瓣膜植入物主要為機械瓣和生物瓣，機械瓣耐用性強，但需終生抗凝；生物瓣雖不需長期服用抗凝藥物，但由于瓣膜衰敗較快，常在10～15 年內需二次手術或介入換瓣[11]。目前常用于降低生物瓣膜免疫原性的戊二醛已被證實其殘留物具有一定的細胞毒性，并會引起強烈的宿主免疫反應，加速瓣膜衰敗[12]。自脫細胞技術開發以來，各種脫細胞瓣膜應運而生，在一定程度上彌補了現有瓣膜植入物的缺陷。

脫細胞同種瓣膜在臨床實踐過程中表現出巨大潛力。一項多中心研究回顧了共計287 例右心室流出道狹窄患者，其中163 例患者接受降低了免疫原性的脫細胞同種異體組織工程瓣膜移植，124 例患者接受了目前標準的同種異體生物瓣置換治療。兩組患者死亡率、精算生存期無差別，組織工程組的右心室流出道功能恢復情況明顯優于標準組。另外，研究者對1 歲以下患者進行了亞組分析，發現與標準組相比，組織工程組患兒的免于再干預率更高，但差異未達到統計學意義，而免于功能障礙率顯著高于標準組，差異具有統計學意義[13]。德國漢諾威醫學院的Tudorache 等[14]報告了64 例接受脫細胞同種主動脈瓣置換的兒童及青少年患者的平均2 年隨訪結果，所有患者術中及術后組織學分析均未發現移植物出現鈣化，再細胞化良好，未觀察到炎癥反應。對10 歲以下患兒進行的亞組分析也印證了以上結果。另外，為進一步證實同種瓣膜的優勢，該團隊中的Sarikouch 等[15]又為364 例患者進行了組織工程同種瓣移植并完成了所有同種異體移植物的術后組織學評估，該試驗共有8 例患者需要術后再移植，同種主動脈瓣和肺動脈瓣的免于再移植率分別為96.1%和98.7%，感染和瓣下狹窄是引起再移植的主要原因。研究者發現，發生感染性心內膜炎患者的再細胞化水平明顯低于未感染者，且使用人造材料會增加發生感染性心內膜炎的風險，故并不建議將人造材料與組織工程瓣膜聯合使用。更有趣的是，在所有接受移植的患者中，組織學檢查評分最優者是一名嬰兒，據報道，患兒在6 周大時即接受了組織工程主動脈瓣置換術，術后患兒的移植物與間充質細胞、平滑肌細胞等具有良好的整體再細胞化率，且幾乎未發現免疫細胞，4.5 年后患兒的無冠竇再細胞化依舊良好。

對主動脈瓣置換患者，目前臨床常采用ROSS手術用于替代現有人工機械瓣和生物瓣，但ROSS術后仍面臨肺動脈瓣假體置換以及二次手術無法取材等問題[5]。最初對原位組織工程瓣膜的嘗試就是將脫細胞豬瓣膜移置入Ross 術后患兒的肺動脈瓣位，然而術后4 例瓣膜均表現出非常嚴重的炎癥反應和鈣化，這可能由脫細胞不完全引起[16]。經過不斷的技術革新，目前脫細胞同種異體組織工程瓣膜已經成功地應用于Ross 手術，能夠維持良好的瓣膜功能和免于再手術率，但在臨床推廣之前，仍應考慮如何解決瓣葉增厚的問題[7]。

作為脫細胞異種和同種基質的替代品，可生物降解的合成和天然聚合物已被引入臨床。聚合物材料沒有異種疾病和排斥反應的風險，并且來源廣泛，易于批量制備。纖維蛋白等天然聚合物，分解產物沒有毒性，不會引起炎癥反應；合成聚合物，如聚乙醇酸等，具有足夠的強度和耐久性，其分解產物可能會引起局部炎癥。聚乙醇酸聚合物支架在先心病血管移植領域已經取得了良好的臨床結果，期待該材料在瓣膜病領域的突破。

此外，間充質細胞可能適用于體外方法設計兒科組織工程瓣膜。該細胞可在出生前或出生后立即獲取，用于合成自體瓣膜組織，以便對患兒及早進行手術換瓣。真皮成纖維細胞是目前更新的一類種子細胞，但目前缺乏足夠的臨床應用實例以證明其可行性。

2.2 組織工程補片和外管道

先天性心臟瓣膜病，常合并多種缺損、畸形，往往需要同時應用人工瓣膜、補片、帶瓣管道等進行修補，故對組織工程補片和外管道的臨床應用進展也進行簡要回顧和綜述。

傳統異種材料補片不具有生長潛能，同樣會導致嚴重的鈣化形成，故目前以自體心包為首選材料，但其缺乏生長潛力，且需二次手術時，往往因炎癥、粘連等導致自體心包不可取用[17-18]。2018 年，萊頓大學醫學中心首次報道了一類新型脫細胞牛心包補片CardioCel 的臨床應用結果[19]。同年Pavy 等[20]回顧了101 例18 歲以下應用CardioCel 治療先心病的患兒。該材料被應用于63 例間隔缺損修補（房間隔缺損3 例、室間隔缺損54 例、完全型房室間隔缺損4 例、部分型房室間隔缺損2 例），24 例血管擴大（升主動脈4 例、主動脈弓部5 例、肺動脈15 例），16例右心室流出道擴大（漏斗部擴大補片11 例、跨環補片5 例），10 例瓣膜重建（主動脈瓣延長或單瓣修復術4 例、Ozaki 手術2 例、二尖瓣成形術3 例、三尖瓣成形術1 例）以及1 例靜脈吻合（Senning 手術1例）。結果顯示，術后30 d 內患兒死亡率3.9%，中位隨訪212 d 期間，共有5 例患者因補片衰敗而進行再手術修補。研究者發現，CardioCel 在術中易于植入，在右心系統低壓區的表現良好，然而左心系統高壓區域中早期即發生移植物衰敗，研究者認為這是由于在正常血壓下，主動脈和CardioCel 補片的彈性出現不匹配，血液對主動脈壁產生剪切力，從而引起內膜反應產生局部組織肥厚，進而導致嚴重的主動脈狹窄。Deutsch 等[21]的研究也在低齡患兒中印證了這一點，研究者對CardioCel 修補后脫落的患者的補片進行了組織形態學分析，發現在5 例＜18的患者中，1 例7 歲主動脈瓣修補的患者補片僅在體內存留的3 d；1 例1 歲行二尖瓣修補的患者，9 d后因補片脫落再次手術修補；1 例部分房室間隔缺損修補術的5 歲患兒補片在其體內存留了237 d。然而在年長兒中（10 歲、16 歲），左心系統補片分別存留了795 d 和1 247 d。5 例脫落補片的組織形態學分析幾乎全部發現肉芽組織層，2 例年長兒補片中均存在膠原基質的輕微碎裂。

2017 年，Bockeria 等[22]首次在5 例單心室病變的兒科患者中植入脫細胞生物可吸收移植物，作為下腔靜脈和肺動脈之間的心外腔肺導管。Sugiura 等[23]對25 例平均年齡5.5 歲的生理學單心室患兒進行了組織工程血管移植，移植物采用聚乙醇酸支架植入自體骨髓單核細胞種植。經過平均11.1 年的隨訪，所有患兒未發生移植物相關死亡，也沒有證據表明有動脈瘤形成、移植物破裂、感染和鈣化等情況的發生。證實了該材料在小兒心血管手術中具有可行性。

另外值得關注的是，2020 年，Fujita 等[18]首次報道了將體內組織工程血管移植物代替自體心包應用于肺動脈重建手術中的嘗試，研究者首先將硅膠引流管制成了組織工程血管模具，在患兒初次手術時植入腹部皮下。其中一例為1 歲男孩，首次手術行姑息性右室流出道疏通，同時植入模具，13 個月后取出并裁剪組織用于肺動脈狹窄的修補；另一例4 歲男孩在初次肺動脈置換術后26 個月，將組織工程移植物用于肺動脈殘余狹窄的修補。其中，該1歲患兒術后五年狀況良好，40 個月CT 未發現狹窄或動脈瘤的形成。初步證實了體內組織工程用作肺動脈狹窄修補的可行性。次年，該團隊補充了體內組織工程血管移植物在先心病中的應用實例[24]，研究者對共計4 例患有主肺側支動脈或合并室間隔缺損的肺動脈閉鎖的患兒施行了體內移植。經過最長4 年的隨訪，所有患者肺動靜脈壓均有不同程度緩解，且并未出現肺動脈再狹窄或瘤樣擴張，故作者認為對于需要多次分期手術的先心病患兒，體內組織工程血管移植物是一種非常有前景的自體心包替代品。

3 討論與總結

對于組織工程瓣膜移植物的研究，還處于臨床前的基礎研究或動物實驗階段。然而不同物種間的免疫系統具有較大差距，在動物實驗中獲得陽性結果，并不能說明能較易轉化為臨床。目前獲得良好臨床反饋的組織工程瓣膜，主要集中在不同材質細胞支架的移植物，其他方向尚未取得突破。初步結果良好的補片和外管道移植物也缺乏更大樣本量數據的支持。目前組織工程在兒科領域的發展，還有非常漫長的路要走，但同樣我們也可以看到許多材料均表現出令人振奮的潛力，希望未來有更多臨床應用的成功實例以及更新組織工程材料的出現，能推動該領域的發展，為先心病患兒帶來新希望。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突