高良姜素對卵巢癌A2780細胞增殖、遷移和凋亡影響的研究

任春慧 馮 晨 李婉玉 方 超 毛藝純 馮 華*

（1.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院核磁共振科，黑龍江 牡丹江，157011；2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院骨外一科，黑龍江 牡丹江,157011；3.牡丹江醫學院病理生理學教研室，黑龍江 牡丹江，157011）

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一。約80%患者就診時已處于晚期。其常規治療方法是手術切除聯合化療藥物，但預后并不十分理想[1-2]。高良姜素（Galangin，GLA）是中藥高良姜的主要活性成分，其不僅具有抗炎、抗氧化、降血脂等作用，而且表現出一定的抗癌活性[3-5]。有研究表明PI3K/AKT信號通路是腫瘤細胞內最重要的信號轉導通路之一，在腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、細胞周期進程及血管形成中發揮著重要作用[6-8]。本研究以GLA為研究對象，旨在探討GLA是否對卵巢癌A2780細胞增殖、遷移以及凋亡能力產生影響，以及是否通過PI3K/AKT信號通路產生抑癌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

GLA（G100561），相對分子量270.24（MW），純度＞98%，購自上海阿拉丁生物科技有限公司。卵巢癌A2780細胞購自 武 漢procell公 司；GAPDH（WL01114）、AKT（WL0003b）、p-AKT（Ser473）（WLP001a）、Bcl-2（WL01556）和Bax（WL01637）抗體（萬類生物，沈陽）；CCK-8試劑盒（博士德，武漢）；BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）；TUNEL細胞凋亡試劑盒（碧云天，武漢）；流式凋亡檢測試劑盒（萬類生物，沈陽）。

1.1.2 儀器設備

酶標儀（生產企業：Molecular Devices公司，型號：SpectraMax 190）；熒光正置式生物顯微鏡（生產企業：日本尼康公司，型號：Eclipse Ci-L）；流式細胞儀（生產企業：美國BD公司，型號：Accuri C6）；CO2恒溫細胞培養箱（生產企業：日本三洋公司，型號：MCO-20AIC）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將卵巢癌A2780細胞加入含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基中，置于37℃、5% CO2的培養箱培養，根據細胞生長情況，隔天換液，鏡下觀察細胞密度達到70%～80%時可以進行傳代。細胞每隔2～3天傳代一次。

1.2.2 CCK-8法

A2780細胞經胰酶消化后，離心5 min，1 000 rpm/min，離心半徑10 cm；制備懸液；使用細胞計數板計數，以8×103個/孔的細胞密度培養于96孔培養板中過夜，每孔加入100 μL完全培養基，平行設置3個重復孔，用不同濃度梯度GLA（0 μmol/mL、1 μmol/mL、5 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL、30 μmol/mL、40 μmol/mL、50 μmol/mL、60 μmol/mL、70 μmol/mL、80 μmol/mL）作用于A2780細胞24 h后，向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，將96孔培養板置入CO2培養箱中繼續孵育1～2 h。于酶標儀450 nm處測定OD值，根據測定的OD值繪制細胞存活率的柱狀圖，細胞存活率（%）=[OD（實驗組）-OD（空白對照組）]/[OD（正常對照組）-OD（空白對照組）]×100%。確定不同濃度作用下GLA對于卵巢癌SKOV3和A2780細胞的影響；計算A2780細胞的IC50值，IC50=1 g-1[Xm-i（∑p-0.5）]。根據IC50值，選取細胞生存率＞60%且數值較高濃度作為GLA給藥濃度，用于后續實驗。同時再根據實驗分組，采用不同時間點（24 h、48 h、72 h）的不同濃度GLA作用于卵巢癌A2780細胞，于酶標儀450 nm處測定各組OD值，根據測定的OD值繪制細胞生存曲線。

1.2.3 細胞分組

取對數生長期細胞加入不同濃度GLA，根據GLA對于卵巢癌A2780細胞的IC50值確定加藥濃度，共分為4個組：①對照組，即0 μmol/mL組；②10 μmol/mL 組；③20 μmol/mL組；④40 μmol/mL組。

1.2.4 細胞劃痕實驗

細胞傳代，以5×106個/孔細胞將A2780細胞常規培養于6孔板中，倒置顯微鏡下觀察，當培養的細胞融合達到80%以上時，用200 μL移液器吸頭在6孔板內做劃痕，每孔用PBS緩沖液沖洗漂浮細胞，再分別加入不同濃度（0 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL、40 μmol/mL）的GLA，在無血清的培養基中繼續培養。在倒置光學顯微鏡下，分別于0 h，24 h，48 h在40倍的放大倍數下拍照獲得圖片。用Image J軟件測量劃痕面積。細胞遷移率=（0 h劃痕面積-24 h/48 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.5 流式細胞術

細胞傳代，以5×105個/孔將卵巢癌A2780細胞常規培養于6孔板中過夜，再分別加入0 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL和40 μmol/mL的GLA在CO2培養箱中繼續培養24 h，將每孔中的細胞用不含EDTA的胰酶消化，將細胞重懸于1 mL預冷的PBS（pH 7.2～7.3）中洗滌2次；調整轉速為1 500 rpm/min，離心半徑6.5 cm，離心10 min；棄上清，加入500 μL比例為1∶100的Binding buffer；在膜聯蛋白結合緩沖液中孵育細胞制備懸浮液，在室溫避光5 min后，首先添加5 μL的Annexin V-FITC，再次添加10 μL的Propidium Iodide進行染色，室溫下避光孵育15 min。在1 h以內用流式細胞儀上機檢測凋亡細胞的百分比，細胞凋亡率（%）=（凋亡細胞數/總體細胞數）×100%，早期凋亡和晚期凋亡細胞均記為凋亡細胞。實驗重復3次。

1.2.6 TUNEL實驗

細胞傳代，以每孔接種1×105個細胞將A2780細胞接種于24孔板中過夜，再分別加入不同濃度（0 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL和40 μmol/mL）的GLA在CO2培養箱中繼續培養細胞24 h，胰酶消化，用PBS緩沖液沖洗2次，將細胞于4%的多聚甲醛在pH 7.4的NaH2PO4溶液中固定30 min，PBS緩沖液洗滌細胞3次，切片浸于0.3%Triton X-100中透化5 min；用PBS緩沖液沖洗3次；在37℃避光情況下向樣品中加入TUNEL 檢測液（50 μL TdT 和450 μL 熒光素標記的dUTP液），避光，37℃孵育60 min；DAPI室溫下復染細胞核15 min；將細胞放入終止緩沖液孵育10 min，蒸餾水沖洗，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡（生產企業：日本OLYMPUS，型號：Olympus BX51）下觀察陽性細胞數，TUNEL陽性產物呈現綠色熒光，DAPI染色細胞呈現藍色熒光。100倍放大視野下隨機選取7個位置進行拍照，并進行細胞計數，凋亡細胞百分比=綠色熒光細胞數/藍色核細胞數×100%。

1.2.7 Western Blot法

細胞傳代，取卵巢癌A2780細胞接種于6孔板中，孵育過夜后用不同濃度（0 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL和40 μmol/mL）的GLA處理細胞24 h，胰酶消化，用4℃預冷的PBS緩沖液沖洗2次，加入RIPA裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），置于冰上裂解0.5～1 h；小心用細胞刮刀將細胞沿同一方向刮下，移入1.5 mL EP管中；在4 ℃、12 000 rpm/min（離心半徑6.5 cm）下離心15 min，小心吸取上清液至標記的預冷1.5 mL EP管中。將蛋白樣品利用BCA法測定蛋白濃度，根據BCA測定試劑盒說明書，配制蛋白標準溶液，根據檢測樣品數量，配制所需BCA工作液，按50（A液）：1（B液）比例，充分混勻備用；將制備好的蛋白標準溶液和蛋白樣品加入到96孔板中，向標準孔和樣品孔中加入BCA工作液，200 μL/孔，在37℃培養箱中繼續培養30 min；用酶標儀測定562 nm波長處每孔的OD值，根據不同濃度標準蛋白品的OD值，繪制標準曲線，計算樣品中總蛋白濃度；計算出Western Blot實驗所需上樣量。按照4（5×蛋白上樣緩沖液）：1（蛋白樣品）配制，100℃金屬浴加熱變性10 min，用于后續Western Blot實驗。將等量的蛋白樣品加入到12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，進行電泳分離，恒流200 mA轉膜2 h左右。用5%脫脂奶粉對PVDF膜進行封閉，加入稀釋的一抗Bcl-2（1∶500），Bax（1∶500），p-AKT（1∶500），AKT（1∶500）以 及GAPDH（1∶500），4 ℃冰箱孵育過夜。次日將過夜的一抗回收，加入TBST洗液，洗滌3次，10 min/次，加入按1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，然后TBST洗滌3次，10 min/次，在避光條件下配制所需ECL發光液，現用現配，配制比例為A液∶B液=1∶1，備用。將PVDF膜上均勻涂滿ECL發光液，在化學發光成像儀（生產企業：美國GE公司，型號：Amersham Imager600）下顯影，GAPDH為內參，用Image J軟件計算灰度值。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 GLA對卵巢癌A2780細胞增殖的影響

CCK-8法結果顯示，在加入了GLA的卵巢癌A2780細胞株中，細胞增殖率減慢，且隨著GLA濃度增加，細胞增殖率越低。見圖1A。根據酶標儀測得450 nm的OD值計算GLA對A2780細胞的半數抑制濃度（IC50）約為52.10 μmol/mL。當GLA濃度達到50 μmol/mL時，A2780細胞存活率不足60%，故將GLA用藥濃度梯度分別設定為0 μmol/mL（即對照組）、10 μmol/mL、20 μmol/mL和40 μmol/mL。細胞增殖曲線結果顯示，隨著藥物作用時間的延長和藥物濃度的增加，與對照組相比，GLA組細胞存活率顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見圖1B。

圖1 GLA對卵巢癌A2780細胞增殖的影響

2.2 GLA對卵巢癌A2780細胞遷移的影響

細胞劃痕實驗結果表明，在劃痕24 h和48 h后，和對照組相比，GLA各組細胞遷移率逐漸降低，劃痕48 h的細胞遷移率明顯大于劃痕24 h的細胞遷移率。見圖2A。A2780細胞在劃痕24 h后，對照組細胞遷移率為（67.83±2.7）%，而GLA組 細 胞 遷 移 率 分 別 為（45.33±2.5）%（P＜0.05）、（29.67±7.2）%（P＜0.01）、（26.67±3.7）%（P＜0.01）；在 劃痕48 h后，對照組細胞遷移率為（86.50±3.5）%，而GLA組細胞遷移率分別為（59.67±4.1）%（P＜0.05）、（49.33±5.0）%（P＜0.01）、（30.33±4.9）%（P＜0.001）。見圖2B。表明GLA可抑制A2780細胞的遷移能力，呈劑量依賴性關系。

圖2 GLA對卵巢癌A2780細胞遷移的影響

2.3 GLA對卵巢癌A2780細胞凋亡的影響

流式細胞術結果顯示，不同濃度GLA作用于A2780細胞，對照組的總細胞凋亡率為（5.27±0.82）%，而GLA組的總細胞凋亡率分別為（6.84±0.82）%，（11.77±0.6）%，（17.79±1.14）%，各組實驗數據差異均有統計學意義（P＜0.05）。在TUNEL實驗中，TUNEL染色細胞呈現綠色熒光，DAPI染色細胞呈現藍色熒光，以TUNEL陽性細胞數與DAPI染色細胞總數之比表示凋亡率。結果顯示，不同濃度GLA作用于A2780細胞，對照組細胞凋亡率最低，而GLA各組隨著藥物濃度的提升，細胞凋亡率呈逐漸上升趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）。數據量化見表1。為了進一步闡明GLA誘導細胞凋亡的機制，應用Western Blot實驗檢測不同濃度GLA作用于A2780細胞其Bcl-2和Bax蛋白的表達情況。與對照組相比，GLA各組Bcl-2表達降低，而Bax表達升高，呈濃度依賴性，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3A、B、C。數據量化見表2。結果表明，GLA以劑量依賴性誘導A2780細胞的凋亡。

表1 A2780細胞各實驗組細胞凋亡率 （±s，%）

表1 A2780細胞各實驗組細胞凋亡率 （±s，%）

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別 細胞凋亡率GLA（0 μmol/mL） 5.97±0.12 GLA（10 μmol/mL） 26.03±4.82*GLA（20 μmol/mL） 33.98±2.87**GLA（40 μmol/mL） 62.20±4.94***

表2 A2780細胞各實驗組Bcl-2、Bax蛋白相對表達量 （±s）

表2 A2780細胞各實驗組Bcl-2、Bax蛋白相對表達量 （±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 Bcl-2 Bax GLA（0 μmol/mL） 1.0±0.1 1.0±0.08 GLA（10 μmol/mL） 0.89±0.08* 1.36±0.1*GLA（20 μmol/mL） 0.70±0.06* 1.61±0.07*GLA（40 μmol/mL） 0.62±0.05* 1.85±0.19**

圖3 GLA對卵巢癌A2780細胞凋亡蛋白的影響

2.4 GLA對卵巢癌A2780細胞PI3K/AKT信號通路蛋白的影響

應用Western Blot實驗檢測經過不同濃度GLA干預后，A2780細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達情況。結果顯示，與對照組相比，GLA各組AKT蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），而p-AKT蛋白的表達顯著下調。p-AKT/AKT的比率呈下降趨勢，并且呈濃度依賴性，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4A、B。數據量化見表3。

圖4 GLA對卵巢癌A2780細胞PI3K/AKT信號通路蛋白的影響

表3 A2780細胞各實驗組p-AKT/AKT蛋白相對表達量 （±s）

表3 A2780細胞各實驗組p-AKT/AKT蛋白相對表達量 （±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別 P-AKT/AKT GLA（0 μmol/mL） 1.0±0.12 GLA（10 μmol/mL） 0.81±0.06*GLA（20 μmol/mL） 0.71±0.06*GLA（40 μmol/mL） 0.58±0.08*

3 討論

隨著人口老齡化的不斷上升，OC患者每年以數十萬的速度持續增長，OC已經成為影響女性生活質量的關鍵要素之一，并且在一些相對不發達國家，防治形勢更為嚴峻。目前臨床上主要缺乏對早期卵巢癌患者特異性診斷方法和行之有效的治療藥物。因此，尋找新的抗腫瘤藥物已成為目前攻克卵巢癌急需解決的關鍵問題。GLA作為一種合成類抗癌藥物，脂溶性較強，通過與癌細胞內蛋白質的融合從而進入其內部來發揮作用。盧丹等[9]發現GLA不僅可以通過線粒體途徑促進胰腺癌PCNA-1細胞凋亡，而且還可以調控LC3-II/LC3-I和P62蛋白表達誘導細胞自噬。還有學者研究表明GLA可以抑制腎癌細胞增殖、遷移和侵襲，并通過線粒體途徑誘導細胞凋亡[10]。

PI3K/AKT信號通路是OC最常見的重要通路，受某些轉錄因子和甲基化修飾的調控，其活性對于平衡細胞增殖和細胞死亡至關重要[11-12]。其對下游的底物分子和蛋白質進行調控，包括PI3K家族成員激活、PTEN功能失調、AKT1和AKT2擴增和mTOR活性降低等[13-15]。當AKT受到刺激之后，會發生磷酸化變成一種多功能蛋白激酶，是機體內重要的信號分子調節點。Gozde等[16]研究證實，AKT的激活可增強腫瘤細胞增殖并抑制其死亡。MK2206是一種變構型AKT抑制劑。它對AKT的亞型表現出了高度特異性的選擇，可以同時靶向AKT1和AKT2。當MK2206與中藥丹皮酚聯合作用于卵巢癌SKOV3和A2780細胞時，這種聯合療法不僅誘導了細胞自噬，而且抑制了小鼠體內腫瘤細胞生長。這說明兩種藥物形成了有效的治療組合，可能最大限度發揮了藥效動力學，顯示出了良好的抗癌效果。但目前國內外文獻報道關于在卵巢癌中GLA作用于PI3K/AKT信號通路的相關研究則鮮有報道。

本研究選取GLA作為研究對象，CCK-8結果顯示GLA可抑制A2780細胞的增殖能力，并呈時間和濃度依賴性，表明GLA能夠抑制卵巢癌A2780細胞增殖活性。其他學者研究表明GLA也可抑制胰腺癌、肺腺癌、胃癌等細胞的增殖。OC的治療難點不僅是卵巢癌細胞的增殖能力強，還有其強大的侵襲遷移能力更是會對臨床治療造成巨大的阻礙。細胞侵襲和遷移能力是評估腫瘤細胞惡性程度的一項重要指標[17-19]。通過劃痕實驗發現經過GLA干預后的卵巢癌A2780細胞向劃痕區域移行減慢，其在劃痕24 h和48 h的遷移率明顯低于對照組。實驗結果證明了GLA能夠顯著抑制卵巢癌A2780細胞的遷移能力，呈劑量依賴性。細胞凋亡可被一些突變基因所破壞，從而導致腫瘤細胞處于失控性生長狀態，并且能夠在復雜的微環境中獲得生存信號[20]。本研究應用流式細胞術和TUNEL實驗檢測出GLA能夠誘導卵巢癌A2780細胞的凋亡，并呈現一定的劑量依賴性。Western Blot實驗結果顯示GLA處理的A2780細胞Bax蛋白表達量增加，Bcl-2蛋白的表達受到了抑制。PI3K/AKT信號傳導通路與OC的發生發展密切相關，一直是眾多學者研究的重點。在本研究中，GLA組AKT蛋白表達無顯著性差異，而p-AKT蛋白的表達顯著下調。p-AKT/AKT的比率呈下降趨勢，并呈濃度依賴性。結果表明GLA能夠顯著抑制PI3K/AKT信號通路激活，主要是通過調控PI3K/AKT蛋白磷酸化來發揮作用。

綜上所述，GLA可能通過調控PI3K/AKT信號通路來抑制卵巢癌A2780細胞的增殖和遷移，誘導細胞的凋亡。通過上述的實驗結果有力地支持了GLA可以作為一種潛在的治療卵巢癌輔助用藥，并提供了理論依據。