核磁共振技術在藥物分析鑒定中的應用

白 玉，姚會娜，王春燕

（鄭州工業應用技術學院 藥學與化學工程學院，河南新鄭 451100）

核磁共振技術是處于靜磁場中的原子核在另一交變磁場作用下發生的物理現象，為現代新型技術。在藥物分析鑒定中，利用該技術以對其分子結構信息進行整合。相較于其他儀器設備，該方法具有難以比擬的獨特優勢，因而在藥物真偽鑒定中，以其定量和定性優勢，在確定新藥結構、化合物中間體及其藥物動力學分析行為上凸顯了明顯的優勢?，F就核磁共振技術在藥物分析鑒定中的應用研究進行綜述。

1 藥物分析鑒定中核磁共振的應用優勢

核磁共振法在藥物分析鑒定中，以其對藥物化學和藥學的研究優勢，成為鑒定分子結構最強有力的工具。加之不對稱合成、手性藥物在開發研究領域的取得的效果，同時也對藥物測定中的對映體純度、構型等提出了更高的要求。

核磁共振技術在研究領域，以其快速性、可靠性、靈敏度高的優點，在手性化合物純度和絕對構型測定中獲得了突出的效果，同時也在識別機理、構象等層面獲得了突破性的進展。在技術層面，形成了類似于手性衍生化試劑法（Chiral derivatizing agents method）、順磁手性位移試劑法、手性溶劑化試劑等的技術方法，且獨具技術上的優勢。

2 該技術在不同藥物中的分析鑒定成效

2.1 環氧化酶-2（COX-2）選擇性抑制劑塞來昔布結構驗證

核磁共振譜（NMR）對塞來昔布的元素組成和化學結構進行測定表明，塞來昔布的化學結構為4-[5-（4-甲基苯基）-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺，用以實現有效解析塞來昔布的光譜特性并推斷其結構，為該類藥物的鑒定及質量控制提供條件[1]。塞來昔布基因毒雜質，其結構經核磁共振檢測，數據如下：1hnmr（dmso-d6400mhz）：7.96（d，2h），7.69（d，2h），7.59（s，2h），7.18（s，1h），7.15（s，4h），2.26（s，3h），其中各峰位移±0.2。具有式ⅰ所示結構的塞來昔布基因毒性雜質，化學名稱為4-（2-氧-5-對甲苯基-3-三氟甲基-吡唑-1-基）-苯磺酰胺，可作為塞來昔布基因毒雜質檢測的對照品，用于塞來昔布及其相關制劑的質量研究和檢測控制，制備塞來昔布基因毒性雜質。

動物實驗的研究結果表明，通過臨床3.0 T MRI檢測大鼠腦、肝臟，檢測后處死大鼠，取腦、肝臟組織石蠟切片，通過熒光顯微鏡觀察組織內熒光，普魯士藍染色觀察組織內鐵粒子位置；結果表明通過RTPCR和Western blot證實COX-2在hBMSCs中成功敲除，與對照組比較，MIRB濃度為10μg/mL時標記率可達到90%，當濃度上升到20μg/mL時標記率可達到98%。

2.2 抗副溶血弧菌海洋真菌HL-3菌株的鑒定

通過篩選培養基種類和鹽度確定其培養條件。從海螺、小黃魚、對蝦等11種樣品中分離出海洋微生物菌株76株，其中真菌26株；篩選得到一株具有抗副溶血弧菌活性的真菌菌株HL-3，鑒定為黃曲霉。黃曲霉HL-3菌株在改良沙氏培養基條件下，產物化學多樣性和抗菌活性較好。通過半制備高效液相色譜制備化合物，以核磁共振波譜數據來達到鑒定化合物結構的效果。黃曲霉HL-3菌株在真菌5號培養基中產物單一且抗菌活性較好，純化出來的化合物結構被鑒定為曲酸。曲酸最小抑菌濃度（對副溶血弧菌）為4.0mg/mL[2]。

2.3 氯唑沙宗的質量控制

采用制備色譜分離提純獲得高純度的雜質E，運用HPLC-MS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC和HMBC等技術手段對5個雜質進行結構確證；采用Waters XBridge C18柱、流動相、梯度洗脫流速參數分別為（250mm×4.6mm，5μm）、10mmol/L，醋酸銨溶液-乙腈、1.0mL/min，檢測波長、柱溫分別為220nm、30℃；通過光譜數據分析，鑒定出氯唑沙宗原料藥中5個雜質的結構，分別為苯并噁唑-2-酮（雜質A）、7-氨基-5-氯-苯并噁唑-2-酮（雜質B）、2-氨基-5-氯苯酚（雜質C）、5-溴-苯并噁唑-2-酮（雜質D）、7，7'-氯唑沙宗二聚體（雜質E）[3]。在0.24mol/L KH2PO4-Na2HPO4（pH 6.81±0.1）支持電解質中，氯唑沙宗于0.80V（vs.SCE）電位處產生一還原波。加入過二硫酸鉀后，該還原波峰電流增加約10倍，峰電位基本不變，產生一極譜催化波。其二階導數峰電流與氯唑沙宗的濃度在2.0×10-7～8.0×10-5mol/L呈良好線性關系（r=0.9981，n=8），檢出限為1.0×10-7mol/L。

2.4 九里香中多甲氧基黃酮分離

多甲氧基黃酮類（Polymethoxylated flavonoids，PMFs）化合物廣泛存在于蔬菜、水果和藥用植物中，并且現代藥理研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多方面藥理活性。而在PMFs化合物結構鑒定的過程中，核磁共振氫譜最為常用且具有簡便、快速、準確的特征。利用高效液相色譜技術對分離產物的純度進行分析，利用核磁共振和質譜技術確定分離獲得的5種多甲氧基黃酮的分子結構[4]。

2.5 制霉素中未知成分（RT6）結構

制備的黏度熒光探針溶于N，N-二甲基甲酰胺中，制成1mmol/L儲備液。從儲備液中取出12μl加入到3mL的離心管當中，用PBS和甘油配成不同比例的黏度值，測量其熒光性質。熒光光譜與磁共振譜圖顯示，隨著黏度的增加熒光逐漸增強。制霉素原料中存在的未知成分為白諾氏菌素；建立的UHPLC方法可用于制霉素原料藥中白諾氏菌素的測定與控制；經NMR和HRMS鑒定，制霉素中未知成分為白諾氏菌素。在建立的色譜條件下，該成分與其他成分分離良好，體外溶出測定實驗中，8 種國產仿制萘普生片在多種溶出介質中的溶出曲線與參比制劑溶出曲線均不相似（f2因子均＜50）；體內預測結果，除參比制劑外，各仿制制劑與實測數值差異均較大。從低到高水平下平均回收率分別為103.6%、99.4%和100.1%，RSD分別為0.33%、1.6%和0.90%，3批供成品中白諾氏菌素的含量檢測結果分別為3.97%、3.41%、3.72%[5]。

3 研究綜述

3.1 藥物或藥物先導化合物中的應用

已知含有吡咯并喹啉母核的氨酰胺類家族化合物具有優良的抗癌活性，從海綿來源鏈霉菌S52-B中分離鑒定了 3個氨酰胺類化合物，其中一個是新結構化合物，不僅豐富了此類化合物家族的結構類型，也為研究其生物合成途徑中的未知機理奠定了基礎，還有利于結合培養條件和基因組信息從這株海綿來源鏈霉菌中挖掘新結構的活性天然產物。高效液相色譜分離純化后，應用高分辨質譜和核磁共振光譜進行化合物結構解析；確定培養基A～D為海洋鏈霉菌S52-B的優勢培養基，基于紫外吸收光譜與質譜分析，從培養基A的大量發酵物中分離鑒定3個具有吡咯并[4，3，2-de]喹啉核心結構的含氯化合物，屬于氨酰胺類天然產物，其中Ammosalic acid為新結構化合物[6]。

3.2 天麻藥材中乳酸脫氫酶抑制劑的分離篩選

以聯用技術快速鑒定、篩選、分離天麻藥材中活性化合物。該方法對于篩選乳酸脫氫酶酶抑制劑具有快速和靈敏等優勢；核磁共振波譜技術對其結構鑒定的結果表明，從天麻藥材中篩選并分離出純度＞90%天麻素、對羥基苯甲醇和巴利森苷A的3個活性成分[7]。

3.3 黑曲霉轉化穿山龍皂苷制備

穿山龍皂苷在黑曲霉的共培養下，各原皂苷成分逐日降低，2～3d后產生新的轉化產物，該產物經分離純化和結構鑒定為薯蕷皂苷元-α-L鼠李糖（1→4）-β-D葡萄糖苷，系薯蕷皂苷失去末端鼠李糖后得到的短糖鏈甾體皂苷，即prosapogenin B，其轉化率為59%。結果表明， 微生物對穿山龍皂苷的生物轉化具有菌種專屬性。黑曲霉Asperillus niger對穿山龍皂苷的生物轉化具有結構專一性，轉化率極高[8]。

3.4 紅樹林來源的放線菌次級代謝產物資源

從紅樹林土壤中篩選出一株可產生抗菌活性物質的抗生鏈霉菌ZFSM1-146，并鑒定出3個抗菌活性成分均為放線菌素類化合物，為后續進行放線菌素的產量優化和通過分子遺傳手段進行結構改造提供了寶貴的菌種資源；采用稀釋涂布平板法分離純化紅樹林土壤中的放線菌，通過瓊脂塊法初篩和濾紙片法復篩獲得具有抗菌活性的放線菌；16S rRNA基因序列分析和系統發育樹構建確定目標放線菌種類；通過高效液相色譜法對目標放線菌的發酵產物進行分析，柱層析-高效液相色譜分離技術結合的活性追蹤法純化抗菌活性物質；經高分辨電噴霧電離質譜和核磁共振波譜技術鑒定抗菌活性物質的結構；從紅樹林土壤中篩選到一株抗菌活性較強的放線菌ZFSM1-146，16S rRNA基因序列及其基因片段構建的系統發育樹分析初步確定其為抗生鏈霉菌（Streptomyces antibioticus）；菌株ZFSM1-146可產生抗菌活性化合物1-3，化合物1-3經結構鑒定分別為放線菌素XOβ、X2和D。經培養基初步優化，抗菌活性最強的放線菌素X2的產量約達到原來的2倍[9]。

4 總結和展望

在現代科技迅捷發展的今天，藥物分子生物學篩選中，核磁共振技術的應用，在環氧化酶-2（COX-2）選擇性抑制劑塞來昔布結構驗證、抗副溶血弧菌海洋真菌HL-3菌株的鑒定、氯唑沙宗的質量控制、九里香中多甲氧基黃酮分離、制霉素中未知成分（RT6）結構中得到了充分的證實，并在藥物或藥物先導化合物中的應用、天麻藥材中乳酸脫氫酶抑制劑的分離篩選、黑曲霉轉化穿山龍皂苷制備、紅樹林來源的放線菌次級代謝產物資源中具有明顯的優勢。綜上所述，核磁共振技術在藥物鑒定中發揮著重要的作用，隨著技術的不斷發展，可為用藥的安全提供技術支撐。

5 結束語

在藥物分析鑒定中，核磁共振技術以對其超強的結構解析能力，進而在藥物結構、中間體化合物及藥物動力學領域成就突出，并在生物醫藥領域、食品科學領域及其環境醫學、海洋等領域中成效突出，并在上述研究中被驗證為科學有效的方法。