植物生長調節劑赤霉素高產菌株的誘變選育

林 璐，彭 輝，聶志奎

(1.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211816；2.江西新瑞豐生化股份有限公司，江西 新干 331300)

赤霉素(GAs)是一種四環二萜類化合物，至今已發現136種，其中活性最強的是GA3[1]。赤霉素作為植物五大激素之一，是一種天然植物生長調節劑，可使種子提前結束休眠、誘導種子發芽、促進莖干生長、誘導開花等，廣泛應用于農業、林業和釀造業，經濟效益顯著，市場前景廣闊[2]。工業上主要通過藤倉赤霉菌深層液體發酵生產赤霉素，但野生藤倉赤霉菌只能少量積累赤霉素，導致赤霉素生產成本較高、產量較低。因此，有必要對藤倉赤霉菌進行誘變選育以提高赤霉素產量、降低生產成本[3]。傳統誘變隨機性大，篩選工作量較大。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變是近年來發展起來的一種新的微生物誘變技術，不僅操作簡單、成本低，而且對遺傳物質的損傷機制多樣，可以提高獲得正向突變菌株的概率，對代謝途徑復雜的次級代謝產物高產菌株的誘變具有獨特優勢[4-5]。

研究報道，赤霉素與麥角固醇共用前體物質香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)[6]。麥角固醇是真菌細胞壁的重要組成成分，一旦合成受阻勢必導致菌體死亡。酮康唑是一種咪唑類廣譜抗真菌藥物，通過高度選擇性干擾真菌的細胞色素P450的活性來抑制麥角固醇的生物合成。因此，以酮康唑為篩選壓力篩選出的抗高濃度酮康唑突變菌株勢必具有較強的麥角固醇合成能力，相應地，也勢必具有較強的赤霉素合成潛力。

因此，作者以酮康唑為篩選壓力，對一株低產赤霉素的藤倉赤霉菌進行ARTP誘變；然后以GA3產量為指標，通過初篩、復篩獲得赤霉素高產菌株，并對該菌株進行遺傳穩定性研究，以獲得遺傳穩定的赤霉素高產菌株，為其工業應用奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

藤倉赤霉菌(Fusariumfujikuroi)CICC 2444，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

PDA斜面培養基(g·L-1)：馬鈴薯塊200，葡萄糖20，瓊脂15；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

種子培養基(g·L-1)：葡萄糖30，酵母膏5.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO41.5，NaMoO4·2H2O 0.05，微量元素溶液1 mL；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

搖瓶發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖60，酵母膏5.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO41.5，NaMoO4·2H2O 0.05，微量元素溶液1 mL；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

發酵罐發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖80，酵母膏5.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO41.5，NaMoO4·2H2O 0.05，微量元素溶液1 mL；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

微量元素溶液(mg·L-1)：H3BO3300，MnCl2·4H2O 100，ZnSO4·7H2O 100，FeCl3·6H2O 200，CuCl2·2H2O 500。配制方法：稱取各成分溶于少量水中，然后滴加鹽酸至溶液澄清，再定容至所需的體積。

1.2 培養方法

PDA斜面培養：在超凈臺中吸取甘油管中的藤倉赤霉菌液200 μL接種到PDA斜面培養基中，置于恒溫培養箱中28 ℃培養2～3 d，直至菌絲長滿整個斜面。

種子培養：取培養好的菌種斜面，用無菌水洗下菌絲體，接種于種子培養基中，于28 ℃、200 r·min-1培養36 h。

搖瓶發酵培養：取種子培養液，按5%接種量接種于搖瓶發酵培養基中，于28 ℃、200 r·min-1培養10 d。

發酵罐發酵培養：取種子培養液，按5%接種量接種于NBS 7.5 L發酵罐發酵培養基中，于28 ℃、200 r·min-1、1 vvm條件下培養10 d。

1.3 菌懸液的制備

取種子培養液5 mL，離心，去上清；用生理鹽水洗滌2次后將菌體移入裝有50 mL無菌水、底部鋪滿玻璃珠的錐形瓶中，于28 ℃、200 r·min-1振蕩20 min；取樣，梯度稀釋，涂布于平板，28 ℃培養2 d后測定菌落數，確定菌懸液濃度在105～106個·mL-1之間。

1.4 酮康唑致死濃度的確定

將一定量酮康唑溶于65%乙醇中，配制成濃度為3 mg·L-1的酮康唑乙醇溶液。取適量酮康唑乙醇溶液加入配制好的平板中，使其濃度分別為5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、50 mg·L-1，以未加酮康唑乙醇溶液的平板為對照組；取100 μL菌懸液涂布于平板，于28 ℃培養2 d后測定菌落數，按式(1)計算致死率：

(1)

1.5 ARTP誘變

ARTP誘變儀(思清源生物有限公司)的操作參數：功率100 W，氦氣流速10 L·min-1，氣壓0.1 MPa。操作前，對操作室進行紫外滅菌30 min；然后取10 μL菌懸液均勻涂于載片上，置于ARTP誘變儀中分別誘變30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s，以未誘變為對照組，每組實驗做3個平行；再移入裝有1 mL無菌水的EP管中，于振蕩器上振蕩1 min，形成新的菌懸液；最后將新菌懸液涂布于平板，于28 ℃培養2 d后測定菌落數，按式(2)計算致死率：

(2)

1.6 赤霉素高產菌株的篩選

初篩：將經過ARTP誘變的菌懸液涂布于含有致死濃度的酮康唑平板上，28 ℃培養2 d后測定菌落數，并將菌落保存。

復篩：將初篩得到的菌落接種于搖瓶發酵培養基中，進行發酵實驗，測定GA3產量，保存產量較高的菌株。

遺傳穩定性考察：將復篩得到的菌株在PDA斜面上進行傳代實驗，測定每代菌株的GA3產量，并與傳代前進行比較，以考察赤霉素高產菌株的遺傳穩定性。

1.7 分析方法

菌株生物量：采用干重法測定。取一定量的菌液，真空抽濾，去離子水洗滌2次，得到的菌絲體經60 ℃恒溫烘干至恒重。

葡萄糖含量：取一定量的發酵液，離心，取上清液100 μL定容至10 mL，用SBA-40C生物傳感器檢測。

GA3產量：采用高效液相色譜法測定。取一定量發酵液，12 000 r·min-1離心5 min，上清液用0.22 μm水系膜過濾后，裝入液相進樣瓶中，進行液相分析。色譜條件：Dionex U3000型高效液相色譜儀，Venusil MP C18色譜柱(填料粒徑5 μm，Agela Technologies)，流動相為甲醇-水-磷酸(體積比68∶32∶0.05)，流速0.8 mL·min-1，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。

2 結果與討論

2.1 酮康唑致死濃度的確定

取100 μL菌懸液涂布于不同濃度酮康唑平板上，28 ℃培養2 d后計算致死率，結果如圖1所示。

圖1 酮康唑濃度對菌株致死率的影響Fig.1 Effect of ketoconazole concentration on lethality rate of strain

由圖1可知，隨著平板中酮康唑濃度的增加，菌株致死率快速升高，在酮康唑濃度增至30 mg·L-1時，菌株致死率達到100%；之后，繼續增加酮康唑濃度，致死率變化不大。因此，確定酮康唑致死濃度為30 mg·L-1。

2.2 ARTP誘變時間的確定

研究[7]發現，致死率越低，正向突變菌株越多，但高產菌株較少；而致死率越高，雖然負向突變菌株越多，但可能存在高產菌株。所以，致死率在70%～80%時的誘變效果是最理想的。為確定最佳ARTP誘變時間，取10 μL菌懸液，分別誘變不同時間，28 ℃培養2 d后計算致死率，結果如圖2所示。

圖2 誘變時間對菌株致死率的影響Fig.2 Effect of mutagenesis time on lethality rate of strain

由圖2可知，隨著誘變時間的延長，菌株致死率不斷升高，當誘變時間為90 s時，致死率接近100%；而當誘變時間為70 s時，致死率為75.1%。所以，選擇70 s為最佳的ARTP誘變時間。

2.3 突變菌株的篩選

將菌懸液經ARTP誘變70 s后，涂布于含有30 mg·L-1酮康唑的平板上，經過初篩，挑選生長良好的菌株接種于搖瓶發酵培養基進行復篩，測定生物量和GA3產量，結果見表1。

表1 突變菌株的發酵性能

由表1可知，經過初篩、復篩，獲得12株GA3產量明顯高于出發菌株的突變菌株。與出發菌株相比，突變菌株的葡萄糖含量與生物量均相差不大，可知ARTP誘變并不影響菌體的正常生長；而目標代謝產物GA3產量卻相差較大，其中突變菌株1-6-4與3-6-1的GA3產量分別達到186.86 mg·L-1和194.64 mg·L-1，較出發菌株分別提高了57%和64%。故，選擇突變菌株1-6-4與3-6-1進行后續實驗。

2.4 突變菌株的遺傳穩定性分析

作為理想的工業化菌株，遺傳穩定是關鍵特性之一。將突變菌株1-6-4與3-6-1分別進行10次斜面傳代培養，測定每代菌株的GA3產量，并與傳代前進行比較，結果如圖3所示。

由圖3可知，傳代9次后，突變菌株1-6-4與3-6-1的GA3產量均趨于穩定，但菌株3-6-1的發酵性能明顯優于菌株1-6-4，GA3產量穩定在180.00 mg·L-1左右，較傳代前(194.64 mg·L-1)僅降低約7.52%。

圖3 突變菌株1-6-4與3-6-1的遺傳穩定性Fig.3 Genetic stability of mutant strains 1-6-4 and 3-6-1

2.5 赤霉素高產菌株發酵罐放大驗證

利用7.5 L發酵罐對赤霉素高產菌株3-6-1的發酵性能進行放大驗證。分時取樣測定葡萄糖含量、pH值、生物量及GA3產量，并與出發菌株的發酵性能進行比較，結果如圖4所示。

圖4 赤霉素高產菌株3-6-1與出發菌株的7.5 L發酵罐發酵性能比較Fig.4 Comparison of fermentation performance of high-yield Gibberellin-producing strain 3-6-1 and original strain cultured in 7.5 L fermentor

由圖4可知：(1)隨著發酵時間的延長，赤霉素高產菌株3-6-1和出發菌株的發酵液中葡萄糖含量均呈下降趨勢，且高產菌株3-6-1發酵液中的葡萄糖含量略高于出發菌株，表明高產菌株3-6-1的葡萄糖消耗量略低于出發菌株；發酵0～24 h耗糖速率明顯低于出發菌株，24 h后耗糖速率基本相同，說明高產菌株3-6-1的延滯期相對較長，對環境適應能力較差。(2)赤霉素高產菌株3-6-1和出發菌株的發酵液pH值均隨著發酵時間的延長逐漸下降直至平穩；發酵0～24 h，高產菌株3-6-1的發酵液pH值低于出發菌株，24 h后，就明顯高于出發菌株。這可能是由于，出發菌株在代謝過程中產生了更多的酸性物質。(3)菌株生物量的變化規律與葡萄糖含量的相反，即隨著發酵時間的延長，高產菌株3-6-1的生物量略低于出發菌株。(4)隨著發酵時間的延長，赤霉素高產菌株3-6-1和出發菌株的GA3產量變化趨勢基本相同，即發酵48 h后，GA3產量均開始快速增加，但高產菌株3-6-1的GA3合成速率明顯高于出發菌株，發酵終產量達到235.98 mg·L-1，較出發菌株提高了87.2%。這可能是由于，pH值是影響GA3產量的重要因素，高產菌株3-6-1的發酵液pH值更適宜合成GA3。

3 結論

以藤倉赤霉菌CICC 2444為出發菌株，采用ARTP誘變，獲得了系列突變菌株，并基于赤霉素代謝途徑的分析，根據赤霉素和細胞壁關鍵成分麥角固醇共享前體物質GGPP這一特征，選擇抑制麥角固醇生物合成的酮康唑為篩選壓力，篩選耐受高濃度酮康唑的突變菌株，建立了一種基于ARTP誘變結合酮康唑為篩選壓力的GA3高產菌株的選育方法。經過抗性初篩和搖瓶復篩，獲得一株赤霉素高產菌株3-6-1，GA3產量達194.64 mg·L-1，較出發菌株提高了64%。經傳代實驗驗證，該菌株遺傳穩定性良好；經7.5 L發酵罐分批放大培養，該菌株的發酵終產量為235.98 mg·L-1，較出發菌株提高了87.2%，具備成為工業菌株的潛力。所建立的赤霉素高產菌株誘變篩選方法既減少了篩選工作量，也提高了篩選到高產菌株的概率，為高產菌株的選育提供了借鑒。