平肝活血散對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響及作用機制初探Δ

宋發萍，張潔，唐勇，劉宗梅，王曉玲（.陜西中醫藥大學第一臨床醫學院，陜西 咸陽 7000；.安康市中醫醫院腦病科，陜西 安康 75000）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）約占卒中總人數的80%，是世界第二大死亡原因和第三大致殘原因[1]。時間窗內靜脈溶栓和動脈取栓是IS急性期的有效治療手段[2]。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI）是IS預后不良的重要因素。細胞凋亡在CIRI病理進程中發揮著重要作用，受p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3等基因的調控，已有研究證實抑制細胞凋亡可減輕CIRI，保護神經功能[3]。

平肝活血散是陜西省名中醫王曉玲教授治療卒中的經驗方，由天麻15 g、赤芍12 g、三七6 g、益母草15 g、竹茹10 g組成，具有平肝熄風、活血化瘀、清熱化痰之功。前期研究證實，該方能促進腦出血患者腦水腫消退，改善超敏C反應蛋白、腫瘤壞死因子表達[4-5]。方中主藥在CIRI中發揮神經保護作用，可有效抑制神經元凋亡[6-7]，但其作用機制尚不明確。為此本研究考察了平肝活血散對大鼠CIRI的影響，初探其作用機制，旨在為明確平肝活血散治療CIRI的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括TB-718EL型組織包埋機（湖北泰維科技實業股份有限公司）、Nikon Eclipse E100型顯微鏡（日本Nikon公司）、RT-6100型酶標儀（美國Rayto公司）、D3024R型臺式高速冷凍離心機[大龍興創實驗儀器（北京）有限公司]、Mini-PROTEAN Tetra型電泳儀（美國Bio-Rad公司）、Odyssey型雙色紅外熒光成像系統（美國Li-Cor公司）等。

1.2 藥品與試劑

平肝活血散配方顆粒劑（批號分別為0052263、0060273、0041413、8111413、0095043，劑量與平肝活血散劑量等效）購自廣東一方制藥有限公司；通心絡膠囊（批號219980015，規格0.26 g/粒）購自石家莊以嶺藥業股份有限公司；4%多聚甲醛溶液（批號AR1068）購自武漢博士德生物工程有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）試劑（批號DY30104-10g）購自上海迪醫明生物科技有限公司；尼氏染液（批號G1036）、TUNEL試劑盒（批號G1507）、BCA蛋白定量檢測試劑盒（批號G2026）、聚偏二氟乙烯膜（批號G6015）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；小鼠β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號8227）、兔抗抑癌p53單克隆抗體（批號33889）、兔抗B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體（批號196495）、兔抗Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）多克隆抗體（批號32503）、兔抗胱天蛋白酶3（Caspase-3）單克隆抗體（批號184787）、兔抗活化Caspase-3（Cleaved Caspase-3）多克隆抗體（批號32042）均購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔和羊抗小鼠免疫球蛋白G二抗（批號分別為ZB-2306、ASP-9100）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；其余試劑均為實驗室常用規格，水為純凈水。

1.3 動物

80只SD雄性大鼠，體質量（200±20）g，購于成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（川）2020-030。動物飼養環境：溫度（22±2）℃，相對濕度（50±10）%。本實驗通過陜西中醫藥大學倫理委員會審批，批準號為SUCMDL20210907001。

2 方法

2.1 造模

大鼠造模前適應性喂養1周，然后參考相關文獻[8]，采用線栓法造模，具體操作如下：大鼠麻醉后固定于木板上，沿頸部正中作2 cm左右縱行切口，鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈；使用手術線結扎頸總動脈近心端，另在頸外動脈和頸內動脈（兩者分叉部位上約2 mm處）用手術線各打一活結，在頸總動脈靠近分叉前1 cm作一“V”切口，線栓進入方向為頸總動脈→頸內動脈，進線栓長度17～18 mm，感覺線栓有輕微阻力時停止推進，此時線栓前端到達大鼠大腦中動脈起始處，立即夾閉頸內動脈防止線栓脫落；1 h后拔出線栓，觀察大鼠眼球顏色，以白色變為紅色，表示CIRI模型造模完成。大鼠造模清醒后，依照Longa評分法對神經功能進行評分：0分表示無神經功能缺損癥狀，1分表示左前爪或后肢無法完全伸展，2分表示行走時左轉或追尾，3分表示爬行時向左傾倒，4分表示意識喪失或不能自主行走[9]；1～3分表明CIRI模型造模成功，評分為0或4分的大鼠被剔除。假手術組大鼠僅分離血管不插線栓。

2.2 分組與給藥

80只大鼠選取12只作為假手術組，剩余大鼠按“2.1”項下方法進行造模，結果有60只大鼠造模成功，成功率為88%。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、陽性對照組（通心絡膠囊0.325 g/kg，根據成人與大鼠等效劑量系數換算臨床等效劑量）和平肝活血散低、中、高劑量組（3.02、6.04、12.08 g/kg，按臨床等效劑量的 50%、100%、200%設置），每組12只。假手術組及模型組大鼠灌胃等體積水，各給藥組大鼠灌胃相應劑量藥液（以水為溶劑制備的混懸液），每日1次，連續14 d。

2.3 檢測指標

2.3.1 神經功能評分 觀察各組9只大鼠干預第1、7、14天的Longa評分。

2.3.2 腦梗死體積 采用TTC法測定。干預14 d后，從每組取3只大鼠，麻醉處死后取腦組織，沿冠狀面切片，厚約2 mm，于2%TTC試劑中37 ℃避光染色30 min，再于4 ℃預冷的4%多聚甲醛溶液中固定2 h，拍照后用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，記錄大鼠腦梗死體積（染為灰白色）及全腦體積（染為紅色），計算腦梗死體積百分比=（腦梗死面積×厚度）/（全腦面積×厚度）×100%。

2.3.3 神經元損傷 采用尼氏染色。干預14 d后，從每組取4只大鼠，麻醉處死后取腦組織，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，行脫水包埋，切片，梯度乙醇水化，甲苯胺藍染液染色后冰醋酸分化，二甲苯透明后，中性樹膠封固，置于顯微鏡下觀察，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析神經元密度（模型組大鼠在取材時死亡1只）。

2.3.4 神經元凋亡 采用TUNEL染色。每組取“2.3.3”項下4只已處死大鼠的腦組織切片，脫蠟，用梯度乙醇水化，蛋白酶K工作液修復，破膜后加buffer室溫平衡，加反應液，4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，封片，置于顯微鏡下觀察（凋亡細胞的細胞核為綠色熒光，正常細胞核為藍色熒光）。

2.3.5 腦缺血皮層中凋亡相關蛋白表達 采用Western blot法檢測。干預14 d后，從每組取3只大鼠，麻醉后予生理鹽水心臟灌流，冰上取腦。右腦組織裂解，提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白定量，添加1/5體積的5×上樣緩沖液，蛋白煮沸變性，電泳后轉至聚偏二氟乙烯膜上，室溫封閉1 h，加入p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃搖床過夜；用1×TBST緩沖液清洗3次，加入相應二抗（稀釋比例均為1∶10 000），室溫避光孵育2 h，用1×TBST緩沖液清洗3次。運用Odyssey型雙色紅外熒光成像系統成像、拍照。借助Image J軟件計算目標蛋白條帶與內參（β-actin）灰度值的比值，以此作為目標蛋白的表達水平。

2.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。符合正態分布的數據以±s表示，方差齊性時，多組間比較采用單因素方差分析，并采用LSD法進行兩兩比較；方差不齊時，多組間比較采用Tamhane’sT2檢驗。不符合正態分布且方差不齊的數據，以M（P25，P75）表示，并采用Kruskal-WallisH檢驗。Longa評分使用兩因素重復測量資料的方差分析進行組間比較。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 大鼠神經功能評分

與假手術組比較，模型組大鼠干預第1、7、14天的Longa評分均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠干預第7和14天的Longa評分均顯著降低（P＜0.05）。與同組干預第1天比較，陽性對照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠第14天的Longa評分均顯著降低（P＜0.01）。與同組干預第7天比較，模型組、陽性對照組和平肝活血散低、高劑量組大鼠第14天的Longa評分均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠的Longa評分比較（±s，n＝9，分）

表1 各組大鼠的Longa評分比較（±s，n＝9，分）

a：與假手術組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與同組第1天比較，P＜0.01；d：與同組第7天比較，P＜0.05；e：與同組第7天比較，P＜0.01

第14天0 2.22±0.67ad 1.33±0.50bce 1.78±0.44e 1.56±0.53bc 1.67±0.50bcd組別假手術組模型組陽性對照組平肝活血散低劑量組平肝活血散中劑量組平肝活血散高劑量組第1天0 2.33±0.71a 2.22±0.44 2.11±0.78 2.33±0.50 2.33±0.50第7天0 2.67±0.50a 2.00±0.50b 2.44±0.53 1.89±0.60b 2.11±0.60b

3.2 大鼠腦梗死情況

與假手術組比較，模型組大鼠右腦呈現明顯的灰白色梗死區，其腦梗死體積百分比顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦梗死體積百分比均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦組織TTC結果

表2 各組大鼠腦梗死體積百分比和神經元密度測定結果

3.3 大鼠神經元損傷情況

假手術組大鼠腦缺血皮層細胞排列整齊，結構完整，著色均勻，尼氏小體染色規則。模型組大鼠腦缺血皮層細胞紊亂，形態不規則，尼氏小體缺失形成空泡。與假手術組比較，模型組大鼠尼氏小體數量明顯減少。與模型組比較，陽性對照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦缺血皮層神經元損傷均有不同程度減輕，尼氏小體數量明顯增加。結果見圖2。

圖2 各組大鼠神經元損傷染色圖（尼氏染色，×400）

與假手術組比較，模型組大鼠腦缺血皮層神經元密度顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦缺血皮層神經元密度均顯著增加（P＜0.05）。與陽性對照組比較，平肝活血散低劑量組大鼠腦缺血皮層神經元密度顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

3.4 大鼠神經元凋亡情況

假手術組大鼠腦缺血皮層未見凋亡細胞，模型組、平肝活血散低劑量組大鼠腦缺血皮層可見大量細胞凋亡。與模型組比較，陽性對照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦缺血皮層凋亡細胞數量均有不同程度減少。結果見圖3。

圖3 各組大鼠神經元凋亡情況（TUNEL染色，×400）

3.5 大鼠腦缺血皮層中凋亡相關蛋白表達

與假手術組比較，模型組大鼠腦缺血皮層中p53、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達均顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦缺血皮層中p53、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），陽性對照組和平肝活血散高劑量大鼠腦缺血皮層中Bcl-2蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）。與陽性對照組比較，平肝活血散低劑量組大鼠腦缺血皮層中上述蛋白表達差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），平肝活血散高劑量組大鼠腦缺血皮層中Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖4、表3。

圖4 各組大鼠腦缺血皮層中凋亡相關蛋白表達的電泳圖

表3 各組大鼠腦皮缺血層中凋亡相關蛋白表達情況（±s，n＝3）

表3 各組大鼠腦皮缺血層中凋亡相關蛋白表達情況（±s，n＝3）

a：與假手術組比較，P＜0.01；b：與假手術組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01；d：與模型組比較，P＜0.05；e：與陽性對照組比較，P＜0.05；f：與陽性對照組比較，P＜0.01

Cleaved Caspase-3 0.12±0.06 0.36±0.08a 0.20±0.05d 0.36±0.05f 0.24±0.03d 0.05±0.02ce組別假手術組模型組陽性對照組平肝活血散低劑量組平肝活血散中劑量組平肝活血散高劑量組p53 0.29±0.07 0.55±0.09a 0.28±0.08c 0.47±0.09e 0.36±0.08d 0.29±0.09c Bcl-2 0.89±0.14 0.50±0.09b 0.86±0.17d 0.51±0.10e 0.61±0.12 0.85±0.15d Bax 0.13±0.05 0.45±0.16a 0.20±0.08c 0.40±0.11e 0.21±0.04c 0.12±0.03c Caspase-3 0.17±0.02 0.39±0.02a 0.28±0.03c 0.40±0.03f 0.28±0.02c 0.16±0.02cf

4 討論

CIRI指腦梗死區域恢復血流后引發更為嚴重損害的病理生理現象[10]。通心絡膠囊是根據中醫絡病理論研制而成的中藥復方制劑，具有益氣活血化瘀、祛風通絡止痛的功效，臨床上常用于治療心腦血管病[11]。動物實驗研究表明，通心絡膠囊可降低CIRI大鼠神經功能損傷評分及腦梗死體積，且抗凋亡作用明確，因此本研究將其作為陽性對照藥物[12-13]。CIRI的主要病理改變為神經元破壞、變性，腦梗死范圍的大小、肢體活動障礙亦可很大程度反映其嚴重程度[14-15]。本研究的尼氏染色實驗結果顯示，與模型組比較，陽性對照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦缺血皮層細胞紊亂、尼氏小體缺損、空泡情況均改善，且神經元密度顯著增加。同時陽性對照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠的Longa評分、腦梗死體積百分比均較模型組顯著降低。這提示中、高劑量的平肝活血散可減輕大鼠CIRI，具有神經保護作用。

細胞凋亡是由多重調節基因共同參與完成的一系列復雜的級聯反應，為腦缺血再灌注后遲發性神經元死亡的主要原因[16]。p53是細胞凋亡連鎖反應的第一關鍵因素，可調控多種細胞凋亡和蛋白轉錄因子的表達。據報道，腦缺血缺氧可激活p53表達增多，隨之調控下游的Bax和Bcl-2蛋白[17]；Bcl-2、Bax是Bcl-2家族調節和執行內部細胞凋亡的關鍵蛋白，在中樞神經系統中都有所表達，Bcl-2是最重要的抗細胞凋亡因子，與Bax作用互相拮抗，可通過介導線粒體、內質網途徑來抑制缺血所致的神經元凋亡[18]。Bax是細胞凋亡啟動的最強決定因素，在凋亡信號的刺激下，Bax移動并插入線粒體外膜形成Bax大通道，致使線粒體外膜完整性被破壞，加速凋亡進程[19]。Caspase-3為凋亡執行蛋白，正常情況下，以無活性酶原的形式存在于細胞質中，其活性形式（Cleaved Caspase-3）的表達是細胞凋亡的標志[20]。Caspase-3的激活主要依賴于線粒體外膜上細胞色素C的釋放，細胞色素C通過半胱氨酸蛋白激酶作用或與凋亡酶激活因子1結合致使胞漿內多種重要的蛋白質被裂解失活，進而細胞核固縮、薄膜發泡、凋亡小體形成，最終發生凋亡[21]。本研究的TUNEL染色實驗結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腦缺血皮層可見大量細胞凋亡；Western blot實驗結果發現，與假手術組比較，模型組大鼠腦缺血皮層中 p53、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達均顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低，這提示p53、Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白參與了神經元凋亡。有研究證實，藥物控制或基因干預使p53、Bax、Caspase-3蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，可抑制神經元凋亡，減輕CIRI，發揮腦神經保護作用[3，22]。本研究結果顯示，與模型組比較，陽性對照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦缺血皮層中p53、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達均顯著降低，陽性對照組和平肝活血散高劑量組大鼠腦缺血皮層中Bcl-2蛋白表達均顯著升高。這提示中、高劑量的平肝活血散可下調p53、Bax、Caspase-3蛋白表達，上調Bcl-2蛋白表達，抑制腦皮層細胞凋亡。

綜上所述，平肝活血散可保護CIRI模型大鼠腦神經，抑制細胞凋亡；其機制可能與下調p53、Bax、Caspase-3蛋白表達，上調Bcl-2蛋白表達有關。