人參內生菌的研究進展＊

凡貞潔，徐靜雅，侯典云，胡灝禹，肖水明＊＊，徐 江

（1.中國中醫科學院中藥研究所 北京 100700；2.河南科技大學農學院 洛陽 471000）

內生菌最早由De Bary在1866年提出[1]，用來定義生活在植物組織內的微生物。廣泛使用的內生菌定義是由Bacon和White提出的：定居在植物的活體內部組織而不會造成任何直接的、明顯的病害癥狀的微生物[2]。植物內生菌種類豐富，分布廣[1-3]。由于它們與宿主植物協同進化[4-5]，有了一些特殊的生物學功能，如間接促進植物生長[6-7]、產生與宿主相似或相同的次生代謝產物[6-8]。

人參（Panax ginsengC.A.Mey.）是人參屬多年生草本植物[9]，生長環境潮濕陰涼，主產于中國東北地區，在朝鮮北部、日本等地也少有分布[10]。《神農本草經》中早有記載，人參可治療肺虛喘促、脾虛泄瀉等癥，具有益血生津，寧神益智等功效，被譽為百草之王[11-12]。人參含有人參皂苷、多糖、甾醇、氨基酸等多種化學成分，具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化、抗過敏等多種藥理作用[13-15]；目前，人參基因組已進行測序和分析，為研究不同藥理活性成分的生物合成途徑奠定基礎[16]。病蟲害、根際微生物影響、生長周期長等會制約人參的產量和品質[17-20]；而植物內生菌具有促進植物生長、提高植物抗逆性的作用，可以提高植物產量[21-22]。因此，內生菌在農業生產中具有重要的應用潛力。

文章主要對人參內生菌國內外的最新研究進行綜述概括，并對未來人參內生菌的研究發展做出展望，以期為今后人參在農業生產、醫藥治療方面提供依據，為今后藥用植物微生物的研究方向以及中醫藥的發展提供參考。

1 人參內生菌分離與鑒定研究方法

研究內生菌的方法包括傳統分離鑒定的培養法和基于分子生物學技術的非培養法。內生菌具有一定程度的組織偏好性，應選取植物的不同組織進行內生菌研究[3]。若采用組織培養法分離內生菌，不同類型的內生菌所用培養基一般不同，內生細菌分離一般采用營養瓊脂（Nutrient Agar,NA）培養基，內生真菌分離一般采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar,PDA）培養基，內生放線菌分離一般采用高氏I號培養基。優點：得到新菌種資源；對分離得到的內生菌進行表征研究。缺點：分離結果易受培養基種類的限制，分離較緩慢。

分離培養方法由于所用培養基不能完全滿足微生物的生長需求，且大多數微生物的培養條件人們還不了解或了解很少，導致分離到的微生物種類很少，不能全面客觀的反映植物微生態系統中微生物的真實狀況。以高通量測序技術為基礎的非培養法則能對微生物進行較客觀的分析，較精確地揭示樣品中微生物種類和遺傳多樣性。通過高通量測序技術在人參基因組方面也取得了一定的研究成果，人參全基因組序列的獲得對人參的選育和栽培具有重大意義[23-24]。二代測序技術具有速度快、準確性高、易操作等優點，三代測序技術（如：PacBio SMRT）則具有可以在物種級別進行分類的優勢[25]。優點：效率高、測序得到的內生菌覆蓋面更廣。缺點：不能對具體菌株進行表征研究，無法保留菌種資源。由表1可知，傳統培養分離方法和高通量測序技術相結合，為微生物的功能研究以及有益微生物的篩選提供了數據。

表1 人參內生菌分離與鑒定研究方法

2 人參內生菌的多樣性

2.1 不同器官內生菌的多樣性

2.1.1根部內生菌的多樣性

目前已從人參植株不同部位分離出數量眾多、不同分類地位的內生菌[34]。李勇等[26]通過平板培養法從人參根中分離得到內生細菌10株，包括Pseudomonasspp.、Stenotrophomonassp.、Bacillusspp.等。Yan等[35]通過組織分離法共分離出了81株內生細菌，包括菌株PDA-2、LB-5和R2A-7等。邱服斌[36]從3年生人參根中 分 離 得 到Bacillussp.、Pseudomonassp.、農 桿 菌（Agrobacterium）等多種內生細菌，另外還有一種新型菌株，定名為Leifsonia ginsengi。人參根部內生真菌有較豐富的多樣性。Wu等[37]以林下山參作為研究對象，從其根部分離得到38株內生真菌，經鑒定將其歸類為9個 屬，分 別 是 叢 赤 殼 屬（Nectria）、曲 霉 屬（Aspergillus）、鐮 刀 菌 屬（Fusarium)、輪 枝 孢 屬（Verticillium）、Engyodontium、Plectosphaerella、青霉屬（Penicillium）、Cladosporium、子囊菌屬（Ascomycete)。

2.1.2莖和葉內生菌的多樣性

Vendan等[38]通過16S rDNA測序對韓國人參內生細菌的多樣性進行分析研究，從人參莖內共得到51個菌落，屬于7個不同屬：Bacillussp.、Staphylococcussp.、Pseudomonassp.、Agrobacteriumsp.、Stenotrophomonas、Microbacterium、Paenibacillus。Hong等[39]將人參莖經組織裂解后涂布在LB瓊脂平板上，通過16S rDNA測序鑒定出阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）、Acinetobacter guillouiae、巨 大 芽 孢 桿 菌（Bacillus megaterium）、Agrobacterium tumefaciens、Bacillus marisflavi、Bacillus safensis等。Khan等[29]進行山參的根、莖和葉片內生菌培養分離實驗時，發現內生菌Bacteroidetes只存在葉片組織中，在根和莖中沒有發現，表明一些菌株具有組織特異性。Gao等[40]從人參葉中分離得到一種內生細菌Paenibacillus polymyxa。

趙智靈等[41]對吉林省不同器官（根、莖、葉）的人參樣品進行內生菌的分離純化研究，發現了對銹腐病菌具有較強抑制效果的內生真菌齒孢青霉（Penicillium daleae）。孫暢[42]從人參葉片中分離獲得18株人參內生真菌，歸屬于Penicillium、枝孢屬（Gladaxporism）、Aspergillus、毛 殼 屬（Chaetomium）和 枝 頂 孢 屬（Acremonium）等8個屬。以上研究說明了人參莖和葉片中內生菌的多樣性和復雜性，部分內生菌可成為人參病害生防菌的新來源。

2.1.3種子和花內生菌的多樣性

Hong等[39]從花梗中分離得到多種內生細菌，主要包 括Acinetobacter pittii、Bacillus amyloliquefaciens、Pseudomonas frederiksbergensis、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）。孫月[43]從人參花中總共分離得到3株內生真菌，經形態學鑒定確定一株內生真菌莖點霉（Phomasp.）可能會產生人參皂苷Re。馬偉等[32]發現人參種子中內生真菌占比最大的為子囊菌門（Ascomycota），優勢菌屬為Fusarium；人參種子中內生菌的分布以及豐度會由于個體不同而產生差異。綜上，人參不同器官內生菌多樣性存在差異。不同器官內生菌研究見表2。

表2 人參不同器官內生菌研究

2.2 不同生長年限內生菌的多樣性

人參在不同生長年限下，其內生細菌的多樣性存在差異。Vendan等[38]發現1年生人參莖段內生細菌以Bacillus為 主，2年 生 的 菌 株 屬 于Bacillus、Pseudomonas、Agrobacterium和Stenotrophomonas，3年生菌 株 屬 于Bacillus、微 桿 菌 屬（Microbacterium）、Agrobacterium和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），成熟的4年生人參莖中主要含有葡萄球菌屬（Staphylococcus），這與邱服斌[36]的研究結果相似，內生細菌多樣性也會隨著參齡增加呈下降趨勢[45]。

人參內生真菌種類繁多，分布與人參植株年齡有關。Park等[30]研究發現Fusarium solani和Phoma radicina分別是1和2-4年生人參根中的優勢內生真菌；Fusarium oxysporum和P.radicina在2-4年生人參中均有分布，在3年生人參根中未發現F.solani；桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride）只出現在1年生人參中，Colletotrichum panacicola只出現在2年生人參中，銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）只出現在3年生人參中。

2.3 不同栽培方式內生菌的多樣性

根據栽培模式不同可以將人參劃分為園參、林下山參和野生人參[45]。雷鋒杰等[46]發現野生撫育人參根內生細菌的群落豐富度和多樣性均高于農田栽參，栽培模式顯著影響人參根內生細菌的多樣性。這與張亞光等[45]的結論一致：栽培環境不同會引起人參內生細菌組成差異。人參的栽培方式不同，其內生真菌多樣性也存在差異。徐麗莉[47]研究發現鉤狀木霉（Trichoderma hamatum）為園參內生真菌的優勢種，鞭毛藻叢赤殼菌（Nectria haematococca）為移山參內生真菌的優勢種。雷鋒杰等[46]發現Ascomycota是3種栽培模式人參根中內生真菌相對豐度最高的類群，占各人參樣品的80%以上。人參不同栽培方式內生菌多樣性見表3。綜上，栽培模式會影響人參內生菌群落豐富度、多樣性以及優勢物種。

表3 不同栽培方式人參內生菌的多樣性

2.4 不同地理區域內生菌的多樣性

不同地理區域的人參內生細菌多樣性存在差異。Khan等[29]以韓國24個地區的山參為研究對象，發現每個門的相對豐度在不同采樣點之間有很大的差異。Cho等[48]對韓國3個不同地區的人參進行研究，發現江華郡是唯一含有節桿菌屬（Arthrobacter）、Rahnella和Microbacterium的采樣點。錦山郡是唯一含有Paenibacillus和歐文氏菌屬（Erwinia）的采樣點。鎮安郡是唯一含有泛菌屬（Pantoea）和Pectobacterium的采樣點；Pseudomonas和Bacillus是比較常見且容易通過培養得到的內生菌，這與李勇等[26]以及Vendan等[38]的研究一致。不同地理區域人參內生菌的多樣性見表4。

表4 不同地理區域內生菌的多樣性

生長年限和栽培方式對人參內生菌多樣性都具有顯著影響[45,46]；對可培養內生細菌進行研究發現，不同地理區域的細菌多樣性水平差異很大；研究可培養內生細菌在不同組織中的分布和多樣性，發現總物種豐富度在葉組織中最高，在莖中最低[29]。綜上，不同地理區域、不同栽培模式、不同生長年限以及不同器官對內生菌的多樣性均有影響。

3 人參內生菌及其次級代謝產物的活性

目前，已有文獻表明植物內生菌對于植物中的有效活性成分或者植物的生長發育等方面都具有一定的促進或者抑制作用[49-50]。Carrion等[51]證明植物內生菌與NRPSs和PKSs編碼的次生代謝物生物合成有關，能夠較好地使植物免受外來病菌侵入，增強植物自身抵抗力。從內生菌中分離的萜類、黃酮類以及生物堿類等活性成分也具有抗癌、抑菌的作用[52]，這將成為新的抗生素和抗癌劑的重要來源。

3.1 內生菌轉化人參皂苷能力

內生菌具有將人參皂苷Rb1轉化為人參皂苷Rd的能力。張薇[53]從人參根中分離得到2株內生真菌灰綠犁頭霉和莫勒接霉，可將人參皂苷Rb1轉化為人參皂苷Rd。陳雪英[54]研究發現內生細菌腸桿菌屬（Enterobactersp.）可將人參皂苷Rb1轉化為人參皂苷Rd。李學[55]發現人參內生細菌P.polymyxa可以促進其它皂苷轉化為人參皂苷Rd。內生菌可將常見人參皂苷轉化為稀有人參皂苷。人參內生細菌Burkholderiasp.將人參皂苷Rb1轉化為人參皂苷Rg3，通過薄層色譜和高效液相色譜確定轉化途徑是Rb1→Rd→Rg3[44，56-57]。Fu[58]分離得到的人參內生細菌黃桿菌屬（Flavobacteriumsp.）將人參皂苷Rb1轉化為稀有人參皂苷Rg3，轉化途徑為Rb1→Gyp-XVII和Rb1→Rd→Rg3，為今后人參皂苷的制備提供了新思路。

Yan等[35]利用高效液相色譜法發現1株內生細菌Agrobacteriumsp.具有較高產稀有人參皂苷Rg3和Rh2的能力。Wu等[37]利用高效液相色譜法發現3株內生真菌具有產人參皂苷能力：在菌株Pg27（Fusariumsp.）與Pg30（Aspergillussp.）的次級代謝產物中檢測出人參皂苷Rb2；在菌株Pg42-1（Verticilliumsp.）的次級代謝產物中檢測出人參皂苷Rc。這為制藥工業制備人參皂苷提供了新方法。人參內生菌及其次級代謝產物統計見表5。

表5 人參內生菌及其次級代謝產物統計

3.2 抗腫瘤活性

鞠鑫等[59]通過16S rDNA分子鑒定、蛋白質印跡法等手段從人參中分離到假單胞菌菌株G13476，并通過研究確定了此菌株對三陰性乳腺癌的調控機制，此結果為今后人參內生菌在抗腫瘤藥物的開發研究提供了新的理論依據。徐麗莉等[27]將從人參根中分離得到的yuan-27、yuan-4、yuan-8、yuan-22等內生真菌進行稻瘟霉模型篩選，選擇完全抑制稻瘟霉孢子萌發的菌株進行抗腫瘤活性篩選，經MTT法檢測確定，發現有5株內生真菌抗腫瘤活性較好，其中yuan-27的抗腫瘤活性最優，為進一步開發抗腫瘤藥物提供了新的研究對象。

3.3 抑菌活性

Kim等[60]發現人參根內生細菌Burkholderia stabilisEB159對人參病原菌具有明顯的抑制作用，從該菌株的代謝產物中也分離出了抗菌活性成分，證實了人參內生細菌的抗菌活性；另外其在進行人參內生真菌抗人參根腐病化合物的全基因組序列分析的研究中也證實了EB159產生的代謝產物吡咯氮可作為潛在的抗菌劑。人參內生菌Trichoderma citrinoviride可以顯著減輕B.cinerea和C.destructans引起的病害癥狀[61]，人參內生菌Trichoderma polysporum對人參病原菌（Alternaria panax、R.solani等）所引起的疾病癥狀具有明顯的抑制作用[62]。這些結果為今后植物內生菌在生物防治方面提供了理論依據。

3.4 其它活性

Kim等[63]從人參內生真菌Penicilliumsp.中分離提取純化得到一種可下調酪氨酸酶和酪氨酸酶相關蛋白等黑色素生成基因表達的代謝產物，但對其酶活性并無影響；證實了該代謝產物具有抑制黑色素生成積累的活性，從而揭示了植物內生菌具有作為護膚化妝品成分的潛在利用價值。這些研究將為今后開發新的抑菌、抗癌藥物甚至是化妝品的研發提供新的參考，為植物內生菌在農藥、醫藥、化妝品行業的發展起到了推動作用。

4 人參內生菌對宿主的影響

植物內生菌與植物之間相互作用影響植物自身及其周圍環境，從而影響植物自身的生長發育[64-65]。Pinski等[66]提出植物內生菌與植物之間的相互作用可增強植物對外界環境變化的耐受性及對病原菌入侵的抵抗能力，從而促進植物自身的生長，達到增產的目的。Giauque等[67]發現植物中的內生菌特性與植物的生活環境以及其脅迫耐受性和資源利用有關。這些研究都為植物內生菌與植物自身之間的相互作用研究提供了新的參考依據。

4.1 增強人參對外界環境抵抗力并促進人參生長

研究發現P.polymyxa可有效降解人參上5種殘留農藥[68]，還具有降低人參葉銹病和根腐病發病率的能力[40]，表明人參內生菌可以提高人參對外界環境的抵抗力，促進人參的健康生長[69]。Hong等[25]對2-6年生的韓國人參進行研究：發現相較其他年限的人參，在3年生的人參根中鐵載體和生長素相關性狀最為突出，并且在3年生人參中檢測到6個促進植物生長基因的表達，表明內生細菌與3年生人參的相互作用有利于根系生長。以上研究為今后植物生物菌肥的研究奠定了良好的基礎。

4.2 促進新的化合物合成

已有研究表明：從桔梗中分離得到的內生菌具有促進新的化合物合成的能力，CGMCC6882菌株能夠在人參皂苷及其內生共生微生物的共同作用下生成多糖，但會受到植物內生共生真菌及植物本身產生的皂苷或者其他活性成分的影響[70]。人參也具有類似的功能，Bao等[71]以人參內生真菌F.oxysporum為原料采用X射線、透射電鏡等方法及技術手段進行了納米銀粒子的合成，合成的新材料在室溫下非常穩定，此研究為今后以植物內生菌為原料合成新的合成材料提供了依據，使今后采用新方法大規模合成生產納米銀材料成為可能。

4.3 提升人參產量與品質

藥用植物內生菌具有生物防治、促進生長的特性，影響藥用植物的次生代謝、生物合成、產量和品質，合理地開發和利用內生菌資源將有利于藥用植物種植業向安全、高品質方向發展[7,72]。在栽培條件下，人參會受到銹腐病、根腐病等病害的影響，而內生菌對于人參病害病原菌具有抑制作用[41]。人參內生菌P.polymyxa處理的1、2、3和4年生人參植株的發病率均低于同齡對照，處理組的平均重量分別比對照組提高31.64%、58.87%、46.70%和18.61%[40]，表明內生菌參與人參病害的生物防治，提高人參的產量。Gao等[40]通過田間試驗研究發現，人參內生細菌P.polymyxa處理的1、2、3和4年生人參植株的平均高度均高于同齡對照組，且總皂苷含量分別比對照組提升36.83%、44.52%、67.96%和79.44%，4年生人參植株中人參皂苷Rd的含量比對照組高308.01%；表明從人參中分離到的P.polymyxa是一種有益內生細菌，可能提升人參的品質。1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶（ACC脫氨酶）在重金屬污染及鹽、干旱脅迫等逆境條件下，能顯著提高農作物的抗逆性和產量，目前已有研究從人參中分離得到產ACC脫氨酶的內生細菌[69]，其對非生物脅迫下人參的促生作用、產量與品質的影響還需進一步研究。

然而，在某些情況下內生菌也會對宿主植物產生一些不利的影響。Faeth等[73]發現在營養缺乏的土地上，未感染內生真菌的亞利桑那羊茅長勢好于感染內生真菌的羊茅。陳佳昕等[74]將從茅蒼術中篩選到的15株內生真菌回接至茅蒼術組培苗，結果發現有3株內生真菌致使組培苗死亡，推測在茅蒼術內生菌中存在部分有害內生菌類型。目前未見人參內生菌負面影響的文獻報道。

5 小結與展望

目前，人參內生菌的研究仍處于起步階段，研究過的人參內生菌數量僅為其巨大資源庫的很少一部分，且多限于內生菌對人參生長發育、有效成分、抑菌性等表觀研究，對其具體作用機制仍不明確。人參內生菌采用的研究方法包括傳統的分離鑒定以及高通量測序技術，涉及多樣性、生物轉化、抑菌活性等多個方面，暫未發現其對宿主具有負面影響。利用現代技術手段，對人參內生菌進行進一步的系統研究亟待開展。目前關于人參內生菌的研究還存在下述問題：①雖然同時采用多種培養基/培養條件進行內生菌的分離，但工作量巨大；②人參內生菌與宿主人參的相互作用及作用機制尚不明確，關于分子機制方面的研究較少；③目前關于人參內生菌的研究依然停留在分離、發酵、抑菌實驗，主要集中在實驗部分，關于人參內生菌的實際應用效果尚未深入研究；④人參內生菌宏基因組測序進展緩慢，如何分離人參內生菌基因組和排除植物基因組數據是研究內生菌-宿主植物相互作用關系的一大阻礙；人參內生菌在人參中增殖和定殖、促生、緩解脅迫方面的研究還未全面開展；在生物和非生物脅迫下，人參內生菌在宿主基因表達、代謝過程以及表型性狀調控中的作用有待進一步研究。

對于人參內生菌未來的研究熱點或將集中在以下幾點：①關于人參內生菌與人參之間的系統進化關系目前尚未有定論出現，這是值得深入研究的方向；②目前人參內生菌與人參之間的相互作用尚未完全闡明，人參內生菌對人參的基因表達、代謝以及其他生理方面的影響等都是值得深入探索的；③人參內生菌中的次級代謝產物及其合成機制等都有待深入研究探索，而對產人參皂苷的人參內生菌菌株，應當加強對其工作機理的研究，進而培育高產內生菌菌株；④宏基因組測序功能基因很難和物種建立一一對應的關系，人參內生菌參考基因集的建立，以及宏基因組學結合培養組學在人參內生菌研究中的應用也將是未來的熱點研究方向。