雙重實時熒光PCR快速鑒別人參和西洋參＊

孫 濤，周 林，滕少娜，何 玲，陳亭旭，任風鳴，潘英文，孔德英＊＊

（1.重慶海關技術中心 重慶 400020；2.國家中藥材物種鑒定及質量安全檢測重點實驗室 重慶 400020；3.重慶市藥物種植研究所 特色生物資源研究與利用川渝共建重點實驗室 重慶 408435；4.海口海關熱帶植物隔離檢疫中心 海口 570311）

人參（Panax ginseng）和西洋參（P.quinquefolium）是五加科人參屬中藥用價值很高的藥材。人參具有大補元氣，補脾益肺，生津養血，安神益智等功效；西洋參能清心安神，養陰潤肺，用于陰虛燥咳，勞嗽咳血，虛煩痙攣，失眠多夢，精神恍惚等[1]。因此，人參和西洋參是備受追捧的名貴滋補良藥，強根固本佳品。但是，目前人參、西洋參市場除正品外，尚有較多的代用品、偽品、混淆品，一些市售藥品、飲片不含標簽明示的人參、西洋參成分，給中藥材市場管理帶來極為不利的影響，因此有必要開展人參、西洋參成分及真假鑒別技術研究。同時，隨著國內外對于中藥材的廣泛認可，人參、西洋參等藥材使用量和采挖量日益加大，開展人參與西洋參的鑒別技術研究，對其進行資源保護和安全合理利用具有重要意義。

有關人參和西洋參傳統的鑒定方法，主要是性狀鑒別，即通過眼觀、鼻聞、口嘗、手摸等手段來對藥物的形狀、大小、顏色、表面特征、斷面、氣味等進行鑒別和描述。但由于這些性狀特征常受到外界環境的影響，需要經驗豐富的專業人員才能進行準確的鑒別，并且隨著制成中成藥后，性狀鑒別難度會進一步增加。現代生物技術的發展為人參屬藥用植物的鑒定提供了新的方法。從1994年隨機引物PCR（randomly primed PCR,AP-PCR）首次用于人參、西洋參的鑒別以來[2]，DNA分子標記技術應用于中藥材鑒別已有不少的報道，包括SCAR[3]、AFLP[4]、PCR-RFLP[5-6]、條形碼鑒定技術[7-9]、RAPD[10]、Bar-HRM[11]等現代分子生物學鑒定手段得到廣泛應用，并逐步隨著DNA分子水平的遺傳分析發展而達到鑒別標準化[12]。在眾多的分子生物學方法中，實時熒光PCR方法因具有準確、快捷、靈敏的特點，而被應用于人參和西洋參的快速鑒別上[13-15]。但是，目前還未有針對人參和西洋參的單管同時鑒別的實時熒光PCR檢測的研究報道。運用多重實時熒光PCR方法能在同一反應中同時對多個靶基因進行檢測，可以減少操作步驟，縮短檢測時間，降低檢測成本。本研究旨在建立一種能同時鑒別人參和西洋參的雙重實時熒光PCR方法，以期為人參、西洋參的快速鑒別提供新的解決方案。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

供試樣品包括7個人參樣品、6個西洋參樣品以及其他10個樣品，共計12種23個樣品（表1）。樣品經國家中藥材物種鑒定及質量安全檢測重點實驗室（重慶）孔德英正高級農藝師鑒定，保存于重慶海關技術中心。

表1 試驗材料信息

1.2 試劑與儀器

磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒購自珠海寶瑞生物公司；Premix Taq? Version 2.0、Premix Ex Taq（Probe qPCR）購自寶生物（大連）有限公司。引物探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

球磨儀為德國萊馳的MM400，全自動核酸提取儀為賽默飛世爾的Kingfisher Duoprime，超微量核酸蛋白檢測儀為賽默飛的NanoDrop one，實時熒光PCR儀為美國ABI stepone plus。

2 方法

2.1 DNA提取

用75%酒精對樣品進行擦洗，清水沖洗晾干后用球磨儀將樣品研磨成粉。隨后按照磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒說明書方法進行樣品DNA提取，提取的DNA用Nanodrop One超微量核酸蛋白檢測儀測定核酸質量和濃度，保存于-20℃冰箱備用。

2.2 引物設計

比對分析人參屬物種及近似種的常用備選條碼基因及18S基因序列，根據人參在18S基因序列中497和501 bp處與其他物種的差異（圖1），利用Primer Express3.0軟件設計特異性引物探針，引物為Pgf（5'-CACGGGGAGGTAGTGACAATA-3'）/Pgr（5'-AGACTT GCCCTCCAATGGAT 3'），探針為Pgp（FAM-CGGGCTG ATTCAGTCT-MGB）。西洋參引物探針在黃永輝等[14]基礎上，對探針做適當調整，引物為Pqf（5'-AGTTGCGCCCGAAGCC ATTA-3'）/Pqr（5'-AGACACG GGAGGCCATTATC-3'），探針為Pqp（VIC-ATCACTCC TTTGC GGGAGTCGA-BHQ1）。

圖1 人參與其近似種的18S序列比對圖

2.3 單重實時熒光PCR

以7個人參樣品、6個西洋參樣品及其他10個樣品，共計23個樣品DNA為模板，進行引物驗證。PCR反應體系為20 μL，包括10 μL 2×熒光PCR反應預混液，上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），探針0.5 μL（10 μmol/L），DNA模板2 μL，滅菌去離子水補至20 μL。實時熒光PCR反應程序為：95℃預變性30 s；然后以95℃5 s，60℃30 s進行40個循環。每個循環中60℃30 s結束時設置熒光通道采集熒光信號。

2.4 雙重實時熒光PCR

應用矩陣法對引物和探針進行最佳配比和篩選，最終PCR反應體系為20 μL，包括10 μL 2×熒光PCR反應預混液，人參引物Pfg、Prg各0.5μL（10μmol/L），西洋參引物Pfq、Prq各0.3μL（10μmol/L），探針Prog、Proq各0.4 μL（10 μmol/L），DNA模板2 μL，滅菌去離子水補至20 μL。實時熒光PCR反應程序為：95℃預變性30 s；然后以95℃5 s，60℃30 s進行40個循環。每個循環中60℃30 s結束時設置熒光通道檢測熒光信號。

2.5 特異性測試

為了驗證該方法是否能夠同時檢出人參與西洋參，在樣品研磨成粉后，取重量相當的人參粉與西洋參粉進行混合，提取混合樣品的DNA做模板進行檢測。共制備4份人參西洋參混合樣品DNA進行檢測，4份混合樣品分別為人參PG-01混西洋參PQ-01、人參PG-02混西洋參PQ-02、人參PG-03混西洋參PQ-03、人參PG-04混西洋參PQ-04。以7個人參樣品、6個西洋參樣品、10個其他樣品以及4個混合樣品共計27份樣品DNA為模板，評價本試驗所建立方法的特異性。

2.6 靈敏度測試

將人參樣品PG-02及西洋參樣品PQ-05的DNA測定核酸濃度后分別稀釋至200 ng/μL，然后等體積混合（混合后，人參及西洋參DNA濃度均為100 ng/μL）,將該混合樣品進行10倍梯度稀釋，稀釋成8個濃度梯度，然后按照2.4中的方法進行實時熒光PCR擴增測試該方法對人參及西洋參的檢測靈敏度，并根據CT值繪制標準曲線。

3 結果

3.1 引物探針驗證

利用設計的人參引物探針對23份樣品的DNA進行驗證，結果顯示7個人參DNA樣品均出現特異擴增曲線，其他非人參樣品及空白對照均無特異性擴增（圖2），表明該引物探針用于人參檢測具有良好的特異性。

圖2 人參實時熒光PCR特異性擴增圖譜

利用引用的西洋參引物探針對23份樣品的DNA進行驗證，結果顯示6個西洋參DNA樣品均出現特異擴增曲線，其他非西洋參樣品及空白對照均無特異性擴增（圖3），表明該引物探針用于西洋參檢測具有良好的特異性。

圖3 西洋參引物探針實時熒光PCR特異性擴增圖譜

3.2 雙重熒光定量PCR探針特異性

應用本實驗建立的方法對7個人參樣品、6個西洋參樣品、10個其它樣品及4個人參西洋參混合樣品共計27個樣品的DNA進行檢測，結果表明7個人參樣品及6個西洋參樣品均出現單條典型擴增曲線（圖4，圖5），4個人參西洋參混合樣品均出現雙條典型擴增曲線（圖6），而供試的其他10份樣品DNA及空白對照均無擴增曲線（圖6），說明該引物與探針用于人參與西洋參檢測具有良好的特異性，所建立的雙重熒光定量PCR方法具有較好的可靠性。注：27份DNA樣品檢測為同一實驗進行，為便于結果觀察，將人參、西洋參及剩余其它處理分別做圖。

圖4 人參樣品雙重熒光定量PCR特異性擴增圖譜

圖5 西洋參樣品雙重熒光定量PCR特異性擴增圖譜

圖6 人參西洋參混合樣品及其它樣品雙重熒光定量PCR特異性擴增圖譜

3.3 靈敏度測試

將人參樣品PG-02及西洋參樣品PQ-05的DNA測定核酸濃度后分別稀釋至200 ng/μL，然后等體積混合（混合后，人參及西洋參DNA濃度均為100 ng/μL），將該混合樣品進行10倍梯度稀釋，稀釋成8個濃度梯度，稀釋后人參及西洋參DNA濃度均為1×105pg/μL至1×10-2pg/μL，取2 μL作為模板用于靈敏度檢測。結果表明人參DNA濃度在1×105pg/μL至1×10-0pg/μL時，均能得到典型的擴增曲線（圖7），西洋參DNA濃度在1×105pg/μL至1×100pg/μL時，能夠得到典型的擴增曲線（圖8）。

圖7 雙重熒光定量PCR檢測人參的擴增圖譜

圖8 雙重熒光定量PCR檢測西洋參的擴增圖譜

人參樣品DNA濃度從1×105pg/μL至1×100pg/μL對應的CT值分別為16.58、20.39、24.62、28.36、32.34、34.89，以擴增曲線的CT值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，繪制標準曲線（圖9），所得線性方程為y=-3.567x+38.557，R2=0.993，擴增效率=90.685%，最低檢測限是2 pg DNA/反應。

圖9 雙重熒光定量PCR檢測人參的標準曲線

西洋參樣品DNA濃度從1×105pg/μL至1×100pg/μL對應的CT值分別為17.73、21.25、24.71、28.61、32.19、35.64，以擴增曲線的CT值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，繪制標準曲線（圖10），所得線性方程為y=-3.59x+42.83，R2=0.998，擴增效率=89.901%，最低檢測限是2 pg DNA/反應。

圖10 雙重熒光定量PCR檢測西洋參標準曲線

4 討論

基于高通量、易操作、易觀察等諸多優點，多重實時熒光PCR技術已廣泛應用于人類疾病檢測、動植物物種及病原微生物鑒定、轉基因檢測等領域[16-19]。在中藥材的鑒定方面多重實時熒光PCR技術也有較廣泛的研究。張全芳等[20]利用多重實時熒光PCR方法來鑒定南柴胡和北柴胡，劉艷艷等[21]將多重實時熒光PCR法應用于藥用貝母屬系統發育關系分析及檢測等。但，關于人參與西洋參的多重實時熒光PCR方面的研究還未見報道。

本研究首先比對分析了人參屬物種常用條形碼基因，根據人參在18S基因（Genebank登錄號：KC593817.1）序列中497和501 bp處與其他物種的差異設計人參特異性引物探針（圖1），西洋參引物探針在黃永輝等[14]基礎上，對探針做適當調整，將發光基團改為VIC。隨后對兩種引物進行驗證，結果發現設計的人參引物探針可以從23份樣品中準確地識別出7份人參樣品（圖2），西洋參引物探針能夠從23份樣品中準確地識別出6份西洋參樣品（圖3）。隨后應用矩陣法對引物和探針進行最佳配比篩選，建立了人參與西洋參雙重實時熒光PCR方法，運用本方法對27份DNA樣品進行檢測，結果顯示7個人參樣品及6個西洋參樣品均出現單條典型擴增曲線，4個人參西洋參混合樣品均出現雙條典型擴增曲線，而供試的其他10份DNA樣品及空白對照均無擴增曲線（圖4、圖5、圖6），表明該方法具有良好的特異性。最后靈敏度測試結果顯示，建立的雙重實時熒光PCR方法檢測人參與西洋參的最低檢測限均達到2 pg DNA/反應，表明該方法具有較高的靈敏度。人參與西洋參樣品在雙重實時熒光PCR反應中擴增曲線的ΔRn峰值較單重實時熒光PCR反應中擴增曲線的ΔRn峰值有明顯降低，從單重PCR實驗的100000左右（圖2）及70000左右（圖3）下降到雙重PCR實驗的40000左右（圖4、圖5），這可能和引物探針添加量降低以及引物探針互相干擾有關。但在比較人參與西洋參樣品在單重實時熒光PCR以及雙重實時熒光PCR實驗中前后的CT值可以看出，差異并不大，說明這種干擾對CT值的影響較小。

人參、西洋參的快速鑒別已有較多研究。劉麗等[22]建立了能同時鑒別人參、西洋參及三七的多重普通PCR方法，只存在150 bp條帶的為人參、只存在400 bp帶為三七，同時存在150 bp和400 bp條帶為西洋參，但該方法無法用于混合樣品的區分，同時該方法的靈敏度在10 ng DNA/反應。實時熒光PCR法靈敏度高，可用于微量甚至痕量檢測[23]，本研究針對人參、西洋參設計特異性引物探針，將人參與西洋參的探針標記上不同的發光基團（人參探針標記FAM發光基團，西洋參探針標記VIC發光基團），當在FAM信號通道檢測到熒光信號時即判定樣品為人參，在VIC信號通道檢測到熒光信號時即判定為西洋參，在兩個信號通道同時檢測到熒光信號時即判定為人參西洋參混品，從而實現對人參、西洋參的同時檢測，可用于人參與西洋參混合樣品的檢測。同時，所建立的雙重實時熒光PCR法檢測人參與西洋參方法靈敏度均達到2 pg DNA/反應，靈敏度也有較大的提升。

本研究針對人參和西洋參的特異性基因序列，建立了一種靈敏度高，準確性好的雙重實時熒光PCR方法，可在單一反應管內同時完成對人參和西洋參的檢測。運用單一的人參DNA、西洋參DNA樣品，混合的人參與西洋參DNA樣品及其他物種的DNA樣品對該方法進行多維度的特異性評價，結果顯示該方法具有良好的特異性。而且，靈敏度測試顯示該方法檢測人參與西洋參的最低檢測限均可達到2 pg DNA/反應。總之，本研究首次建立了人參西洋參雙重實時熒光PCR檢測方法，該研究降低了檢測成本，提高了檢測效率，可應用于人參、西洋參成分的快速檢測，可辨別樣品中是否含有相應成分，在藥品真偽鑒別領域具有一定的應用前景。