穩(wěn)定性冠心病血瘀證的血漿定量蛋白質(zhì)組學(xué)探析＊

楊 光，何浩強(qiáng)，諶子諾，周思遠(yuǎn)，王 階＊＊

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)狹窄、阻塞，引起心肌缺血、缺氧的心臟病。穩(wěn)定性冠心病是冠心病的慢性階段，臨床表現(xiàn)為間斷發(fā)作的心絞痛或心肌缺血癥狀，威脅著患者的生活質(zhì)量和遠(yuǎn)期預(yù)后[1,2]。穩(wěn)定性冠心病的管理以生活方式干預(yù)，強(qiáng)化藥物治療和減少危險(xiǎn)因素為主[3]。但即使經(jīng)過(guò)有效管理，有些患者仍會(huì)出現(xiàn)心肌缺血癥狀。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療可降低心絞痛的發(fā)作次數(shù)，但會(huì)引起5%至10%的再狹窄風(fēng)險(xiǎn)，且難以改善心血管遠(yuǎn)期預(yù)后[4-5]。以上問(wèn)題表明，冠心病需要開(kāi)發(fā)新的個(gè)體化治療策略，來(lái)改善療效和預(yù)后。中醫(yī)藥通過(guò)個(gè)體化施治，能夠顯著降低心絞痛發(fā)作的次數(shù)和程度，并改善血栓形成相關(guān)指標(biāo)和患者的生活質(zhì)量[6,7]。血瘀證是冠心病的主要證候之一，也是證候生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，已經(jīng)在DNA、RNA、蛋白質(zhì)、代謝物等多個(gè)層面展開(kāi)探索，并取得了階段性成果，挖掘出許多與證候相關(guān)的標(biāo)志物分子[8-11]。蛋白質(zhì)是機(jī)體生物學(xué)功能的執(zhí)行者，與中醫(yī)證候具有許多相似點(diǎn)與聯(lián)系，兩者都是機(jī)體即時(shí)功能狀態(tài)的反映，挖掘蛋白質(zhì)組有利于從表層原因?qū)用嫣骄孔C候的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)[12]。非數(shù)據(jù)依賴性采集模式（data independent acquisition，DIA）作為一種新的譜圖采集模式，將質(zhì)譜的全掃描范圍分為若干個(gè)窗口，然后對(duì)每個(gè)窗口中的所有離子進(jìn)行檢測(cè)、碎裂，從而無(wú)遺漏、無(wú)差異地獲得樣本中所有離子的信息。能夠降低樣本檢測(cè)的缺失值，同時(shí)提高定量準(zhǔn)確性和重復(fù)性[13]。有鑒于此，本研究采用DIA定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)方法，篩選冠心病血瘀證的特征性差異蛋白，探索其關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程，為中醫(yī)證候的客觀化研究與冠心病個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究中，疾病觀察組納入5例穩(wěn)定性冠心病血瘀證患者，病例收集于廣安門醫(yī)院門診及病房。對(duì)照組納入5例健康成人，健康受試者來(lái)源于在校研究生，收集于2020年11月至2021年1月。穩(wěn)定性冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)發(fā)布的《穩(wěn)定性冠心病診斷與治療指南》，主要包括慢性穩(wěn)定性型心絞痛和急性冠脈綜合征之后的穩(wěn)定期階段[14]。血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2018年中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)發(fā)布的《冠心病心絞痛證候要素診斷標(biāo)準(zhǔn)》，證候要素得分相加≥8分即可診斷[15]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合穩(wěn)定性冠心病的疾病診斷及血瘀證的證候診斷；②年齡在30-75歲之間；③自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

血漿去高豐度蛋白試劑盒(小柱子)ThermoFisher批號(hào)85165；血漿去高豐度蛋白試劑盒(大柱子)Millipore批號(hào) 122642；SDS裂解液 碧云天 批號(hào)P0013G；BCA試劑盒ThermoScientific批號(hào)23227；磷酸 國(guó)藥 批號(hào)10 015418；胰酶 華利世 批號(hào)HLS TRY001C；無(wú)水乙醇GENERALREAGENT批號(hào)G73537B；異丙醇GENERALREAGENT批號(hào)G75885B；TiO2島津5020-75000；丙酮 沃凱 批號(hào)40 064485；iRT Biognosys批號(hào)Ki-3002-2；Q Exactive HF質(zhì)譜儀ThermoFisher；臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀 批號(hào)TGL-16A；酶標(biāo)儀 上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司 批號(hào)ST-360；高pH分離液相色譜儀Agilent 1100 series；96孔SPE除鹽柱ThermoFisher批號(hào)60309-001。

1.3 蛋白質(zhì)提取

①采集研究對(duì)象的空腹靜脈血后分裝于2 ml乙二胺四乙酸抗凝管內(nèi)。在4℃3000 rpm/分鐘條件下離心15分鐘，取上清液，分裝于微型離心管中。②采用白蛋白/IgG去除試劑盒去除高豐度蛋白。每個(gè)樣品取40 μL血漿，用結(jié)合緩沖液十倍稀釋血漿。③準(zhǔn)備好分離柱后，加入稀釋的樣本，讓其靠重力流過(guò)柱體，就初步實(shí)現(xiàn)了高豐度蛋白的去除。之后兩次加入緩沖液清洗柱體。④在樣本中加入300μl SDS裂解液，將溶液在室溫下12000×g離心10 min，取上清，再重復(fù)離心后取上清獲得樣品的總蛋白溶液。

1.4 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

①按照二辛可寧酸試劑盒說(shuō)明書，根據(jù)buffer A:Buffer B=50∶1配置顯色液。②取出部分待測(cè)蛋白溶液，加超純水進(jìn)行稀釋。③準(zhǔn)備一個(gè)干凈的96孔板，加入如下梯度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：0、1、2、4、8、12、16、20μg/μL，然后每個(gè)孔加入相應(yīng)體積的超純水補(bǔ)充體積至20μL。④將2μL待測(cè)蛋白溶液加入96孔板，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，同樣補(bǔ)充體積至20 μL。⑤各孔內(nèi)加入200 μL預(yù)配制的顯色液，37℃反應(yīng)30 min。⑥使用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度值測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入待測(cè)樣品的吸光度值，計(jì)算出蛋白濃度。

1.5 蛋白質(zhì)酶解和肽段純化

將蛋白樣品還原并烷基化后，酶解為長(zhǎng)度適合質(zhì)譜檢測(cè)的肽段，然后去除鹽離子和其他雜質(zhì)。①根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，調(diào)整不同樣品到相同的濃度和體積。②在蛋白溶液中加入二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)，在55℃孵育30 min，還原蛋白中的雙硫鍵。③在冰上進(jìn)行冷卻直到達(dá)到室溫。④加入相應(yīng)體積的碘乙酰胺。⑤加入丙酮沉淀蛋白。⑥4℃,8000×g離心10分鐘收集沉淀，加入1/50樣品質(zhì)量的1mg/ml胰酶，并于37℃過(guò)夜。⑧加磷酸調(diào)PH值為3左右終止酶解反應(yīng)。⑨用200μl甲醇活化96孔SPE除鹽柱，上樣，調(diào)節(jié)真空和液滴速度。⑩用甲醇清洗2次，最終得到干燥的肽段。

1.6 LC-MS/MS高分辨質(zhì)譜檢測(cè)

質(zhì)譜進(jìn)樣前，每個(gè)樣品按照標(biāo)準(zhǔn)品:待測(cè)樣品=1∶10的體積比混合，作為內(nèi)標(biāo)。首先是液相分離，將所有酶解后的樣本取等量肽段混合，使用Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)，在pH=10的流動(dòng)相中進(jìn)行組分分離。其次是質(zhì)譜分離，高壓泵將存儲(chǔ)環(huán)中的液體推入與質(zhì)譜相連的分析柱中，流速為1 uL/min，采用30SPD方法進(jìn)行分離。離子源將肽段轉(zhuǎn)化為肽段離子，采集肽段離子的一級(jí)譜圖，并根據(jù)質(zhì)核比(m/z)篩選用于二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)的肽段，最終形成二級(jí)譜圖

1.7 數(shù)據(jù)解析

質(zhì)譜輸出的譜圖，用理論譜圖進(jìn)行匹配。使用Spectronaut Pulsar軟件進(jìn)行搜庫(kù)與鑒定。

1.8 差異蛋白表達(dá)分析

利用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到原始數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)的預(yù)處理。若某一蛋白質(zhì)的缺失值占比≥50%，則將此蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)剔除。缺失值≤50%的蛋白用同組樣本均值填充缺失值，經(jīng)Median Normalization及l(fā)og2對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，得到可信蛋白數(shù)據(jù)。不同組別中的可信蛋白平均值相減，得到log2FC。由log2FC可以反推得到差異倍數(shù)（FC,fold change）。采用Excel的t.test公式計(jì)算p.value。計(jì)算FC閾值在1.5水平下的差異蛋白質(zhì)表達(dá)情況，并通過(guò)R語(yǔ)言的Ggplot2包繪制火山圖進(jìn)行可視化展示。檢驗(yàn)學(xué)水準(zhǔn)設(shè)定為0.05。

1.9 生物信息學(xué)分析

根據(jù)1.8的差異蛋白質(zhì)結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。分析各組間差異蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)基因的GO功能富集及KEGG通路富集情況，利用R語(yǔ)言clusterProfiler包繪制氣泡圖。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)得到差異蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)，采用Cytoscape軟件進(jìn)行優(yōu)化，并采用cytoHubba程序（MNC算法）計(jì)算節(jié)點(diǎn)數(shù)量輸出核心蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

10例受試者的人口學(xué)資料和疾病用藥情況如表1所示。為了突出冠心病血瘀證和健康人的差異性，冠心病患者來(lái)自心血管科病房或門診，健康對(duì)照組為體檢正常的在校研究生。患者經(jīng)過(guò)門診及病房系統(tǒng)確認(rèn)冠脈狹窄＞50%或植入過(guò)支架。由于疾病觀察組和對(duì)照組來(lái)自不同的人群，兩組在年齡、體重、合并疾病數(shù)量、服藥數(shù)量方面不具有可比性。

表1 受試者基線特征表

2.2 質(zhì)量控制

在DIA檢測(cè)的肽段中，蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度包括五個(gè)量級(jí)，載脂蛋白A-I(APOA1)表達(dá)水平最高，而鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(NPC2)表達(dá)水平最低（圖1）。各樣品的平均偏差和DIA數(shù)據(jù)點(diǎn)均符合標(biāo)準(zhǔn)，表明該蛋白質(zhì)組定量方法準(zhǔn)確。對(duì)可信蛋白進(jìn)行樣品相關(guān)性分析，結(jié)果表明樣品之間的分組情況和重復(fù)性良好（圖2）。為了監(jiān)測(cè)液相色譜-質(zhì)譜的穩(wěn)定性和定性定量數(shù)據(jù)的可靠性，在樣品隊(duì)列中，每隔一段時(shí)間，在一定數(shù)量的樣品中插入一個(gè)質(zhì)控樣品進(jìn)行相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)均在0.9以上。

圖1 蛋白質(zhì)相對(duì)豐度圖

圖2 樣品相關(guān)性圖

2.3 差異蛋白質(zhì)表達(dá)分析

當(dāng)FC=1.5時(shí)，冠心病血瘀證組相比于健康對(duì)照組，共鑒定到22個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)，9個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)（表2、圖3）。其中上調(diào)的蛋白質(zhì)包括：免疫球蛋白輕鏈λ型可變區(qū)3-25（IGLV3-25）、免疫球蛋白重鏈可變區(qū)3-23（IGHV3-23）、免疫球蛋白重鏈可變區(qū)3-43（IGHV3-43）、免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)域（IGHA2）、免疫球蛋白重鏈可變區(qū)3-49（IGHV3-49）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、免疫球蛋白輕鏈λ型可變區(qū)6-57（IGLV6-57）、免疫球蛋白重鏈可變區(qū)3-9（IGHV3-9）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2（IGFBP2）。下調(diào)的蛋白質(zhì)包括：免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)1D-13（IGKV1D-13）、免疫球蛋白λ型多肽1（IGLL1）、多聚蛋白2（MMRN2）、一種內(nèi)皮細(xì)胞受體（ROBO4）、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑（SERPINA5）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白復(fù)合物亞基（IGFALS）、富含半胱氨酸酸性分泌蛋白類似蛋白1（SPARCL1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）、多泡體亞單位12B（MVB12B）、白蛋白（ALB）、L選擇素（SELL）、補(bǔ)體因子H（CFH）、補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白1（CFHR1）、血小板糖蛋白Ib α鏈（GP1BA）、血清血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTS1）、細(xì)胞間黏附分子2（ICAM2）、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）、凝溶膠蛋白（GSN）、載脂蛋白L1（APOL1）、球蛋白/維生素D結(jié)合蛋白（GC）、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1（ECM1）、磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（PLTP）。

圖3 冠心病血瘀證組與健康對(duì)照組的差異蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果

表2 冠心病血瘀證組與健康對(duì)照組的差異蛋白質(zhì)表達(dá)情況

2.4 差異蛋白的GO富集分析

對(duì)31個(gè)差異蛋白質(zhì)（對(duì)應(yīng)基因）進(jìn)行GO富集分析，其生物學(xué)過(guò)程及分子功能的分析結(jié)果如圖4所示。有11個(gè)基因富集在補(bǔ)體激活過(guò)程(complement activation)和體液免疫過(guò)程(humoral immune response)，有10個(gè)基因富集在（細(xì)胞）吞噬過(guò)程(phagocytosis)。有9個(gè)基因富集在B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)過(guò)程(B cell mediated immunity)。有7個(gè)基因富集在膜內(nèi)陷(plasma membrane invagination)過(guò)程(表3)。

圖4 冠心病血瘀證組與健康對(duì)照組的差異蛋白質(zhì)GO富集分析（top10）

表3 冠心病血瘀證組與健康對(duì)照組差異蛋白質(zhì)的GO富集分析

2.5 差異蛋白的KEGG富集分析

對(duì)31個(gè)差異蛋白質(zhì)（對(duì)應(yīng)基因）進(jìn)行KEGG富集分析，其通路富集的結(jié)果如圖5所示。富集到3個(gè)以上基因的信號(hào)通路有一條，為：補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的作用通路（complement and coagulation cascades）（如圖6所示）,圖中的FH即為CFH，PCI即為SERPINA5，CFHR1/2/3/5即為CFHR1。

圖5 冠心病血瘀證組與健康對(duì)照組的差異蛋白質(zhì)KEGG富集分析

圖6 補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)

2.6 差異蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析（圖7、圖8），排名前10的核心蛋白質(zhì)是ALB、CRP、TTR、CFH、GC、GSN、SELL、SERPINA5、GP1BA、IGFBP3。其中，ALB屬于高豐度蛋白，應(yīng)予排除。CFH基因與其他基因的互作程度較高，來(lái)源于實(shí)驗(yàn)研究與既往文獻(xiàn)報(bào)道。此外，GCTTR、ALB-TTR、ALB-CRP互作關(guān)系的綜合評(píng)分均較高。故初步推斷冠心病血瘀證的核心蛋白質(zhì)為C反應(yīng)蛋白（CRP）、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）、補(bǔ)體因子H（CFH）、維生素D結(jié)合蛋白（GC）等。

圖7 冠心病血瘀證差異蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)

圖8 冠心病血瘀證的核心蛋白質(zhì)

3 討論

《素問(wèn)·痹論》言“心痹者，脈不通……痹在于骨則重，在于脈則血凝而不流”。《內(nèi)經(jīng)》最早用“血凝”來(lái)描述胸痹的形成過(guò)程，提示“血瘀”是冠心病的基本病機(jī)。血瘀證是證候生物學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。當(dāng)前，血瘀證已被證明不僅與血小板結(jié)構(gòu)、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素及冠狀動(dòng)脈狹窄程度密切相關(guān)[16]，在基因?qū)用嬉泊嬖谠S多調(diào)控靶點(diǎn)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[10,11]。血瘀證相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究始自2005年[17]，既往研究大多數(shù)采用基于雙向電泳或雙向熒光差異凝膠電泳的蛋白質(zhì)膠點(diǎn)鑒定[18-20]，也有少數(shù)采用基于iTRAQ或Label-free的定量蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)序[21,22]。這些研究發(fā)現(xiàn)了一批血瘀證相關(guān)的蛋白質(zhì)或肽鏈標(biāo)志物，為血瘀證的客觀化診斷提供了眾多分子靶標(biāo)，但存在檢測(cè)技術(shù)的不足。本研究采用高通量質(zhì)譜鑒定技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)方法，對(duì)冠心病血瘀證的蛋白質(zhì)表達(dá)差異作進(jìn)一步分析。

在差異倍數(shù)為1.5時(shí)，研究共鑒定獲得31個(gè)差異蛋白質(zhì)，其中22個(gè)蛋白質(zhì)低表達(dá)，9個(gè)蛋白質(zhì)高表達(dá)。其中有代表性的蛋白質(zhì)如C反應(yīng)蛋白、多種免疫球蛋白超家族表達(dá)增加，轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白L1、維生素D結(jié)合蛋白、磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、多聚蛋白2、補(bǔ)體因子H、補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白1等表達(dá)下調(diào)，反映機(jī)體的炎癥水平增高，正常代謝及營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備下降。補(bǔ)體水平下調(diào)可能是因?yàn)槁匝装Y反應(yīng)的消耗所致。對(duì)這些差異蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，GO富集分析結(jié)果顯示：有11個(gè)基因富集在補(bǔ)體激活、補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑、免疫反應(yīng)過(guò)程中。KEGG信號(hào)通路查詢確定了補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的信號(hào)通路。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果表明C反應(yīng)蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、補(bǔ)體因子H、維生素D結(jié)合蛋白等是核心蛋白質(zhì)。由于三部分結(jié)果皆指向補(bǔ)體系統(tǒng)，筆者推測(cè)冠心病血瘀證的生物學(xué)過(guò)程與補(bǔ)體參與的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)，補(bǔ)體因子H是核心蛋白質(zhì)。

補(bǔ)體系統(tǒng)是固有免疫應(yīng)答的重要組成成分，體內(nèi)經(jīng)氧化修飾的低密度脂蛋白和膽固醇結(jié)晶等會(huì)激活補(bǔ)體系統(tǒng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[23]。其中，補(bǔ)體因子H（CFH）是一種負(fù)調(diào)節(jié)因子，可以避免補(bǔ)體系統(tǒng)過(guò)度激活所致的炎癥反應(yīng)，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[24]。既往多篇報(bào)道表明，補(bǔ)體因子H基因的多態(tài)性可能影響人對(duì)冠心病的傾向性，如CFH 1277CC基因型可能導(dǎo)致女性更易患冠心病，或者增加發(fā)生不穩(wěn)定心絞痛的風(fēng)險(xiǎn)[25-27]。另外，CFH抑制補(bǔ)體的活化過(guò)程，常依賴補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白（CFHR）的調(diào)節(jié)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。CFHR的表達(dá)下降或缺失，會(huì)引起補(bǔ)體激活的旁路途徑發(fā)生紊亂，臨床上可導(dǎo)致IgA腎病、腫瘤等疾病[12]。本研究中，CFHR1、CFH皆屬于顯著下調(diào)的差異蛋白質(zhì)，說(shuō)明了補(bǔ)體系統(tǒng)代謝紊亂與冠心病血瘀證的重要關(guān)系。GO富集分析和KEGG信號(hào)通路圖的結(jié)果也表明補(bǔ)體參與的慢性炎癥反應(yīng)是冠心病血瘀證的重要生物學(xué)過(guò)程。

有學(xué)者提出，血瘀證的生物學(xué)基礎(chǔ)研究已深入到各類炎癥因子和炎癥介質(zhì)，小分子炎癥介質(zhì)有望成為探究血瘀證物質(zhì)基礎(chǔ)的新思路[28]。而目前關(guān)于補(bǔ)體系統(tǒng)與血瘀證相關(guān)性的報(bào)道較少，本研究提供了合理依據(jù)，提示補(bǔ)體參與的慢性炎癥反應(yīng)可成為未來(lái)科學(xué)研究的方向，其中補(bǔ)體因子H具有成為標(biāo)志物分子的潛力。本研究也存在一些不足，例如，研究納入的樣本量較小；研究納入的患者未記錄冠脈狹窄程度，導(dǎo)致患者的信息不全；觀察組與對(duì)照組在年齡、體重等方面不具有可比性，這些因素可能成為重要的混雜因素。研究未對(duì)補(bǔ)體因子H進(jìn)行擴(kuò)大樣本量的驗(yàn)證，日后還需完善方法學(xué)設(shè)計(jì)，以豐富血瘀證相關(guān)理論為目標(biāo)，以明確活血化瘀藥物作用靶點(diǎn)為導(dǎo)向，系統(tǒng)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)揭示血瘀證的科學(xué)內(nèi)涵。