基于代謝組學探討艾灸關元穴對老年大鼠腎能量代謝的影響＊

王 慧，陳麗梅，徐瑞祥，陳 釗，周娟清，卓文浩，劉紅寧＊＊

（1.江西中醫藥大學 南昌 330004；2.江西中醫藥大學附屬醫院 南昌 330006；3.啟東市人民醫院 南通 226200）

《素問·上古天真論》中以女子七、男子八為基數遞進描述了生長、發育、衰老曲線與腎氣盛衰相關聯。人之生長壯老，皆由陽氣為之主[1]，陽化氣的過程相當于物質代謝產生能量的過程[2]。且對人體生命而言，陽是人體溫熱的能量[3]。隨著年齡的增大，制造能量的線粒體會積累活性氧誘導的損傷，導致線粒體功能下降[4-5]。動物實驗顯示，24月齡大鼠離體心肌線粒體膜脂類物質多不飽和脂肪酸含量隨年齡的增加而明顯下降[6]。大鼠睪丸線粒體膜多不飽和脂肪酸的含量隨年齡的增加而明顯下降，且飽和脂肪酸的比例增加，因此多不飽和脂肪酸的百分含量下降[7]。有研究顯示老年小鼠腦線粒體耗氧速率明顯低于青年小鼠[8]，可能是呼吸鏈的活性較低所致，而琥珀酸脫氫酶（SDH）是線粒體的關鍵酶，參與細胞能量所需ATP的生物合成，有研究顯示衰老對小鼠心室肌細胞SDH水平有明顯的抑制作用[9]，影響線粒體的正常功能，因此線粒體是生命能量的創造者，線粒體的功能對衰老細胞的影響至關重要。

《扁鵲心書》提出“人于無病時，常灸關元……，雖未得長生，亦可保百余年壽矣。”這種以灸法預防衰老的方法稱為“保健灸”[10]。艾灸燃燒時可通過熱效應、光輻射和藥效應等將熱量傳入人體，為機體細胞代謝活動提供必要的能量，也能為能量缺乏的病態細胞提供活化能[11]。關元穴為元氣所存之處，趙小恒[12]認為獨灸關元進行養生，可以起到補益元氣、溫腎健脾、溫中散寒、補腎納氣、溫暖下元、延年保健的作用。研究表明艾灸關元穴可以改善阿爾茨海默?。ˋD）小鼠的三羧酸代謝和不飽和脂肪酸代謝來改善AD動物的學習記憶功能[13]。金匱腎氣丸有溫補腎陽、行氣化水之效，且是溫補腎陽、延緩衰老的代表方[14]，本文以此藥作為該研究的觀察對比用藥。

代謝組學主要用于分析生物生理與病理狀態下內源性小分子代謝物的差異，通過數據分析，可以檢測出生物體代謝產物的微小變化，與中醫藥的整體性、動態性原則相吻合[15]。艾灸作為一種治療方式靈活、費用低廉的預防保健手段，其作用機制值得進一步研究。

基于此，本實驗選取自然老齡化大鼠為研究對象，通過觀察腎臟病理狀態、腎功能水平、線粒體呼吸耗氧速率和琥珀酸脫氫酶的活性，利用代謝組學技術研究艾灸關元穴對老年大鼠腎代謝的影響，初步探討艾灸關元穴對老年大鼠補腎陽的作用機制。

1 實驗方法

1.1 主要儀器與試劑

安捷倫超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜儀（美國Aglient，1290-G6538）；真空離心濃縮儀（美國Thermo Fisher，SPD131DDA-P1-230）；高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher，LYNX6000）；多功能酶標儀（瑞士Tecan，Spark 10M）；高通量冷凍組織研磨儀（美國SPEX，Geno2010）；紫外可見分光光度計（日本島津，UV-2600）；全自動生化分析儀（美國Beckmancoulter，AU480）；石 蠟 包 埋 機（徠 卡，EG1150）；石蠟切片機（徠卡，RM2016）；顯微鏡（明美，MF43）；金匱腎氣丸（北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，產品批號：20030989）；5%金匱腎氣丸含藥飼料（上海帆泊生物技術有限公司，批號：20200831）；艾條（江西鄱艾生物科技有限公司，艾絨比∶8∶1，直徑8 mm）；HPLC級甲醇、乙腈（德國Merck）；甲酸（Dikma Pure，批號：2486917）。SM0020線粒體提取試劑盒（Solarbio，批號：20201027）；ab197243細胞外氧氣消耗量試劑盒（Abcam，批號：GR3351604-2）；琥珀酸（Solarbio，批號：225E081）；蔗糖（西隴科學，批號：191202）；氯化鉀（KCl）（西隴科學，批號：200301）；乙二醇雙2-氨基乙醚四乙酸（EGTA）（MACKUN，批號：C10916981）；氯 化 鎂（MgCl2）（西 隴 科 學，批 號：20180730）；磷酸氫二鉀（K2HPO4）（西隴科學，批號：180608）；琥珀酸脫氫酶（SDH）測試盒（南京建成，批號：20201221）；總蛋白定量（考馬斯亮藍法）（南京建成，批號：20201209）；肌酐（Cr）、尿酸（UA）、尿素（UREA）血清試劑盒均購自湖南海源醫療科技股份有限公司（批號：20210129、20201110、20200925）。

1.2 實驗動物和樣品收集

8月齡、21月齡雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（許可證號：SCXK（湘）2019-0004）。大鼠適應性喂養1周，喂養過程中由于老年大鼠自然衰老死亡1只，故將8月齡SD雄性大鼠作為成年對照組（n=8），21月齡雄性大鼠隨機分為老年對照組（n=8）、老年金匱腎氣丸組（n=7）、老年艾灸組（n=8）。老年艾灸組大鼠參照《大鼠標準穴位圖譜》取穴，將穴區1.0 cm左右的鼠毛剃干凈，艾灸時大鼠用黑色襪子套頭，保持老鼠躺平的姿勢，艾條在穴區上方2 cm左右燃燒，保持溫熱感，使老鼠舒適安靜。每日艾灸關元穴（CV4）15 min，5日1療程，實驗持續13周，其余組大鼠均按相同的方法和時間抓取。老年金匱腎氣丸組每日分框按大鼠體重喂食5%含藥飼料，給藥劑量由成人臨床用量10 g/60 kg的6.3倍換算而來，同樣5日1療程，實驗持續13周。

實驗結束后，禁食不禁水12 h，解剖后腹主動脈取血，將血液在室溫下靜置2-3 h，4℃條件下3500 rpm離心15 min，放入-80℃冰箱，備用。取血后摘取新鮮腎組織，PBS緩沖液洗凈殘留血液，濾紙吸干，立即切取100 mg用于提取線粒體。另取一部分腎組織經4%多聚甲醛溶液固定24 h，制作成HE染色病理切片，剩下的組織放于-80℃保存，供試劑盒檢測和代謝組學研究。

1.3 大鼠血清腎功能的測定

采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清肌酐（Cr）、尿酸（UA）、尿素（UREA）含量。

1.4 觀察腎組織形態變化

將腎組織從多聚甲醛中取出，石蠟包埋、切片、HE染色，采用光學顯微鏡進行病理組織學觀察。

1.5 線粒體外耗氧速率實驗

1.5.1提取線粒體

取新鮮腎組織100 mg，放入預冷的Dounce勻漿器內，添加1 mL預冷的Lysis Buffer進行勻漿。取出上清，按說明書操作進行梯度離心，最后棄上清，得高純度線粒體沉淀。

1.5.2線粒體代謝速率測定

緩 沖 液 的 配 制：250 mmol·L-1蔗 糖，15 mmol·L-1KCl，1 mmol·L-1EGTA，5 mmol·L-1MgCl2，30 mmol·L-1K2HPO4，PH=7.4，過濾除菌。

向細胞外氧氣消耗試劑中添加1 mL雙蒸水，并充分混勻，測時用緩沖液稀釋制成重組探針。向明底黑色壁的96孔板中加入重組探針100μL、線粒體50μL和100 mmol/L琥珀酸底物50μL?？瞻讓φ湛字兄患尤刖彌_液200μL。立即用37℃高靈敏度礦物油（2滴）密封每個孔，并除去氣泡。將96孔板插入預熱至37℃的酶標儀，Ex/Em=380/650 nm條件下持續檢測信號10-30 min。

1.6 琥珀酸脫氫酶（SDH）活性

取儲存于-80℃冰箱的腎組織，用生理鹽水按重量體積比1∶9制備成組織勻漿液，在4℃條件下3500 rpm離心10 min，取上清，按試劑盒說明書操作。組織蛋白的測定采用考馬斯亮藍法。

1.7 代謝組學檢測

1.7.1腎組織樣品前處理

將樣本從-80℃冰箱中取出，稱取腎組織200 mg，加入1.5 mL預冷的水：甲醇（20∶80）進行低溫勻漿，渦旋振蕩3-5 min。然后，在4℃條件下以15000 rpm離心15 min，吸取上清液，低溫濃縮使其干燥。將殘渣用甲醇復溶，混勻，在4℃條件下以15000 rpm離心15 min。最后從每個樣品上清液中取10μL混合作為QC（quality control）樣品以監控整個實驗，經0.22 μm有機濾膜濾過后上機檢測。

1.7.2色譜條件

安捷倫超高液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜（UHPLC-Q-TOF-MS）；色譜柱為ZORBAX Extend-C18（2.1×100 mm，3.5 μm，Agilent），流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為乙腈；梯度洗脫條件：0-8 min，2-28% B；8-10 min，28-54% B；10-15 min，54-71% B；15-18min，71-88% B；18-19 min，88-100% B；19-20 min，100-2%B；20-21 min，2%B。進樣量6μL，柱溫35℃，樣品室溫度4℃，流速0.4 mL·min-1。

1.7.3質譜條件

采用雙電噴霧離子源（Dual ESI），正離子模式下，干燥器溫度：350℃，流速10 L·min-1，掃描方式：Full Scan，掃描范圍：m/z 50-1000，毛細管電壓：4000 V，噴霧室壓力：35 psig，碎片電壓：175 V，錐孔電壓：65 V。負離子模式下，毛細管電壓：3500 V，其余條件同正離子模式。

1.8 統計方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），符合正態分布且方差齊以LSD檢驗法進行組間比較。P＜0.05表示差異具有統計學意義。實驗結果均采用平均值±標準差（xˉ±s）表示。

2 結果

2.1 腎組織形態結構

光學顯微鏡結果顯示成年對照組大鼠腎小球結構正常，均勻分布于腎皮質中（圖A1，A2）；老年對照組腎小球體積略微增大，偶見間質淤血，腎小管管腔中偶見嗜酸性蛋白液，形成管型（圖B1，B2）；老年金匱腎氣丸組腎小球體積略微增大，腎小管管腔中偶見嗜酸性蛋白液，形成管型（圖C1，C2）；老年艾灸組腎小球體積略微增大，偶見間質淤血，但程度較老年對照組減輕（圖D1，D2）。

2.2 艾灸關元穴對血清腎功能的影響

結果顯示，與成年對照組大鼠比較，老年對照組大鼠腎功能水平無顯著性差異（P＞0.05），與老年對照組大鼠比較，老年金匱腎氣丸組大鼠腎功能水平無顯著性差異，老年艾灸組大鼠血清Cre含量顯著降低。結果見表1。

表1 大鼠血清腎功能水平的比較（±s）

表1 大鼠血清腎功能水平的比較（±s）

注：與老年對照組比較，#P＜0.05。

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2.3 艾灸關元穴對腎線粒體耗氧速率的影響

對OD值下降曲線進行線性回歸，得到線性回歸方程，方程斜率的絕對值越大說明線粒體代謝速率越快。與老年對照組比較，成年對照組大鼠腎線粒體耗氧速率顯著高于老年對照組（P＜0.01），老年金匱腎氣丸組和老年艾灸組均能顯著升高老年大鼠腎線粒體耗氧速率（P＜0.01）。結果見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織線粒體耗氧速率比較

2.4 艾灸關元穴對腎組織SDH酶活力的影響

實驗結果顯示，隨著年齡的增長，老年大鼠較成年大鼠的腎組織SDH酶活力顯著降低（P＜0.01）；與老年對照組比較，老年金匱腎氣丸組和老年艾灸組大鼠的腎組織SDH酶活力均顯著升高（P＜0.01），結果見圖3。

注：與老年對照組比較，##P＜0.01。

圖1 各組大鼠腎組織形態結構

2.5 艾灸關元穴對腎組織代謝模式的影響

2.5.1腎組織代謝物譜的UHPLC-Q-TOF-MS分析

正、負離子模式下成年對照組、老年對照組、老年金匱腎氣丸組、老年艾灸組大鼠腎組織總離子流圖譜見圖4。從圖中可以看出，樣本重疊性較好，說明儀器運行穩定。正離子模式下老年對照組相較于成年對照組腎組織總離子流圖發生了明顯的變化，說明隨著年齡的增長，老年大鼠腎組織代謝產物發生了變化，且艾灸關元穴和金匱腎氣丸給藥使老年大鼠腎組織代謝產物接近成年對照組大鼠。

圖4 正負離子模式下各組大鼠腎組織總離子流圖

2.5.2多元統計分析

將數據導入SIMCA 14.1軟件并采用有監督模式的偏最小二乘法判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）方法對各組腎組織樣本進行代謝輪廓分析。分析結果顯示，正離子模式下老年金匱腎氣丸組和老年艾灸組沒有完全分離開（圖5A），負離子模式下老年對照組和老年金匱腎氣丸組沒有完全分離開（圖5B）。但是通過三維圖可知，正離子模式下老年金匱腎氣丸組和老年艾灸組只有個別樣本分離不開，說明兩者代謝譜是接近的（圖5C），負離子模式下老年對照組和老年金匱腎氣丸組能夠很好的分開（圖5D）。正負離子模式下金匱腎氣丸和艾灸關元穴對老年大鼠腎代謝物都產生了明顯影響。為了驗證模型可靠性，對PLS-DA模型數據進行200次隨機排列實驗，結果表明，模型驗證結果顯示左側所有R2和Q2值低于右側原始點，Q2截距值等于或小于0，表明模型未產生過分擬合，此模型可靠[16][截距：R2=0.702，Q2=-0.109（圖5E）；R2=0.34，Q2=-0.37（圖5F）]。

圖5 正負離子模式下大鼠腎組織代謝物PLS-DA得分圖和置換檢驗

2.5.3潛在生物標記物的分析

通過MPP軟件分析，篩選出Fold-change＞2及P＜0.05的代謝物作為潛在生物標志物，通過HMDB數據庫結合二級質譜信息對篩選出的大鼠潛在生物標記物進行鑒定指認。以保留時間RT 16.28，m/z 280.2633的離子為例，通過分子特征提取，得到[M+H]+（m/z 280.2635），分子式C18H33NO在MassHunter中得分值比較高，在MS/MS圖譜中主要有m/z 55.0538、m/z 83.0858、m/z 95.0870、m/z 124.1195、m/z 175.1490、m/z 245.2212、m/z 265.0197、m/z 280.2635的碎片離子，通過與HMDB數據庫進行匹配，發現與亞油酰胺化合物的圖譜最吻合，對應數據庫m/z 55.0542、m/z 83.0855、m/z 245.2264、m/z 280.2635。因此該化合物被鑒定為亞油酰胺，見圖6。利用此方法在正離子模式中鑒定出4個共同潛在生物標記物，分別是丁酸十二烷基酯、亞油酰胺、5-甲基四氫葉酸、PC(16：0/22：5(7Z，10Z，13Z，16Z，19Z))，在負離子模式中鑒定出9個共同潛在生物標記物，分別是6,8-二羥基嘌呤、1,2,3-丙烷三羧酸、3-(4-甲氧基苯基)-2-氧代丙酸、吲哚-3-乙酰甘氨酸、亞麻油酸、9,10-環氧十八烷酸、二十二碳五烯酸(22n-6)、?；悄懰?、LysoPS(18:0/0:0)。結果見表2。

表2 腎組織中鑒定的潛在生物標記物及變化趨勢

圖6 亞油酰胺二級質譜圖

2.5.4代謝通路

將鑒定所得潛在生物標記物數據帶入在線數據庫MetaboAnalyst 5.0進行通路富集分析，結果顯示潛在生物標記物主要參與亞油酸代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x、葉酸參與的一碳單位代謝、α-亞麻酸代謝、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、初級膽汁酸生物合成，見圖7。

圖7 大鼠腎組織代謝通路圖

3 討論

陰陽五行學說中把對于人體具有推進、溫煦、興奮等作用的物質和功能統歸于陽[17]，中醫認為，腎陽為各臟陽氣之本，對各臟腑、組織器官起著推動、溫煦的作用，腎陽得以溫煦，則人體機能活動旺盛。線粒體是真核生物進行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場所，其負責的最終氧化的共同途徑是三羧酸循環與氧化磷酸化[18]。琥珀酸脫氫酶是線粒體內膜的結合酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一[19]。作為參與三羧酸循環的關鍵酶，琥珀酸脫氫酶是反映線粒體功能的標志酶之一。本研究結果顯示，青年大鼠腎組織線粒體呼吸耗氧速率和琥珀酸脫氫酶的活力明顯高于老年大鼠，由此可見，青年大鼠處于生長發育階段，其腎氣旺盛，而其代謝也處于旺盛階段。隨著年齡的增長，機體腎功能下降，且與線粒體功能有關[20]。陽氣是人體熱量的來源，金匱腎氣丸給藥和艾灸關元穴后都能夠提高老年大鼠的腎組織線粒體功能，推測艾灸可能通過影響線粒體三羧酸循環中的中介物質來提高腎組織的能量代謝，從而進一步推動腎陽的溫煦作用。

能量代謝系統是需氧生物體內分布于線粒體的普遍代謝途徑，是糖類、脂類、氨基酸代謝聯系的樞紐。牛磺膽酸為一種常見的結合型膽汁酸，?；悄懰嵊赡懰岬聂然c?；撬岬陌被怎０锋I結合而成，參與脂類的消化吸收[21]，在人類機體中，膽汁酸合成的減少與年齡增長有關。牛磺酸是參與多個氨基酸代謝與能量代謝的關鍵蛋白轉化節點，牛磺酸和亞?；撬岽x路徑側面反應了機體的能量代謝水平[22]。有研究提到牛磺酸含量下降60%與嚴重的呼吸鏈功能障礙有關[23]，細胞?；撬岷慕邥档秃粑δ懿⒃黾泳€粒體超氧化物的生成[24]，可能會使呼吸鏈復合物I（NADH氧化酶）和III（細胞色素c氧化還原酶）的活性下降，耗氧量減少[25]。有研究[26]表明長期補充低劑量的牛磺酸可以減輕與SD大鼠年齡相關的O2消耗下降，并且能夠提高比目魚肌和胃肌中SDH基因的表達，提高肌肉SDH活性，說明牛磺酸與能量代謝密切相關。本實驗的代謝組學結果顯示，?；悄懰嵩诶夏杲饏T腎氣丸組和老年艾灸組的腎組織中含量下降且與成年對照組趨勢一致，牛磺酸的含量可能升高，側面反應出艾灸關元穴能夠調節老齡化機體的能量代謝水平。

亞麻酸和亞油酸是人體中重要的必須脂肪酸，α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）是n-3多不飽和脂肪酸（EPA、DHA）合成前體，二十二碳五烯酸（Docosapentaenoic acid，DPA）是ALA在體內生成二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的中間產物。n-3多不飽和脂肪酸被報道可以改善線粒體功能，增加心肌細胞中的線粒體質量[27]，減緩小鼠線粒體蛋白質質量隨年齡的下降[28]。補充人體必備脂肪酸被證明可上調線粒體解偶聯蛋白（UCP）的表達，保持氧化還原狀態，從而在能量代謝中起著關鍵作用[29-30]。亞油酸已被證明可以防止心磷脂含量降低并改善患有自發性高血壓心力衰竭（HF）的老年大鼠的線粒體功能[31]。細胞膜和線粒體膜的主要磷脂組分是甘油磷脂，磷脂（PL）的脂肪酸（FA）組成對線粒體膜功能有很大影響[32]，有研究表明線粒體膜的脂質組成與線粒體在能量代謝和氧氣消耗中的作用有關[33]。本研究中結果顯示，金匱腎氣丸和艾灸關元穴可使老年大鼠腎組織中亞麻油酸、二十二碳五烯酸和亞油酰胺含量升高，推測艾灸和金匱腎氣丸可能都通過促進亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、甘油磷脂代謝來提高老年大鼠腎組織能量代謝。

綜上，本實驗通過對老年大鼠血清腎功能、腎組織形態結構、線粒體耗氧速率和琥珀酸脫氫酶活力的檢測，并從代謝組學分子層面觀察艾灸關元穴對老年大鼠腎組織能量代謝的影響。其中，老年艾灸組和老年金匱腎氣丸組與老年對照大鼠相比，腎結構狀態和腎功能指標均無顯著性影響，說明長期艾灸補陽與從內服用藥物補陽對老年大鼠的腎功能均無明顯損害作用。不少學者認為，腎陽虛和機體能量代謝是密切相關的[34-36]。艾灸關元穴能夠提高老年大鼠腎組織線粒體能量代謝的功能，側面反應出艾灸關元穴可通過溫補腎陽的作用促進腎的能量代謝，這種作用可能是通過?；撬岷蛠喤；撬岽x、α-亞麻酸代謝、亞油酸代謝、甘油磷脂代謝來調控的。艾灸具有治療方便、經濟、安全，易被患者接受等特點，是一種有潛力的保健方法，值得進一步發掘以發揮中醫藥在治未病中的主導作用。