健脾清化顆粒對胃食管反流病脾虛濕熱證病證結合大鼠食管黏膜肥大細胞活化的影響＊

車 慧，王鳳云，張佳琪，謝璟儀，唐旭東＊＊

（1.中國中醫科學院西苑醫院脾胃病研究所 北京 100091）

胃食管反流病（Gastroesophageal reflux disease，GERD）是胃內容物（食物、胃酸、膽汁等）反流入食管或口腔，引發不適癥狀和（或）并發癥的一類疾病。除典型癥狀反酸和燒心外，臨床表現極具異質性。GERD為復雜因素致病，食管的病理改變不能完全反應癥狀的嚴重程度。流行病學調查發現，我國約82.8%有反流癥狀的患者內鏡下未見食管黏膜損傷[1]。目前，引發反流相關癥狀的機制尚未完全闡明。除異常酸暴露外，當食管上皮抵抗力減弱時，感覺閾值下降，正常的酸暴露也可引起癥狀的發生[2]。MCs是介導神經源炎癥的重要細胞，廣泛分布于胃腸道黏膜固有層和黏膜下層，又被稱為免疫系統和神經系統的橋梁。其活化受到炎性因子和神經肽的調節，并通過自分泌、旁分泌等方式發揮正反饋效應，加重外周的神經源炎癥，導致食管黏膜下層的神經末梢敏化，進一步通過中樞神經系統的傳導，引起食管感覺異常。在藥物治療上，相對于質子泵抑制劑（Proton pump inhibitors，PPIs）單靶點的作用機制，中醫藥在針對GERD復雜病機的治療上則更具優勢。

GERD易反復發作，病程遷延。久病以虛實夾雜證多見，脾虛濕熱證為臨床常見證型[3]。健脾清化顆粒（黨參、黃連、蒼術等11味中藥組成）是中國中醫科學院西苑醫院脾胃病研究所唐旭東教授長期以來治療脾虛濕熱型GERD的經驗方，臨床實踐基礎較好。本實驗以SD大鼠為研究對象，探討了GERD脾虛濕熱證大鼠食管粘膜MCs的活化情況及健脾清化顆粒的干預機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠由斯貝福生物技術有限公司提供72只（8-12周齡），許可證號：SCXK（京）2016-0002。由西苑醫院實驗動物中心飼養，動物室條件為Ⅱ級，室溫22-25℃，相對濕度45-60%，顆粒飼料喂養、自由飲水。該實驗通過中國中醫科學院西苑醫院醫學倫理委員會審查（No.2019XLC008-2）。

1.2 藥物

健脾清化顆粒浸膏粉由西苑醫院制劑室制備，每克干粉相當于6.06 g生藥，25℃以下室溫保存。奧美拉唑片（批號H20044871，每片10 mg），由山東新時代藥業有限公司生產。

1.3 儀器設備與試劑

醫用石蠟、無水乙醇、4%多聚甲醛、二甲苯、蘇木素-伊紅染色液及中性樹膠等（中國中醫科學院西苑醫院病理科提供），甲苯胺藍染色液（上海歌凡生物科技有限公司，批號：M026），Anti-Mast Cell Tryptase（abcam，批號：ab2378），anti-PAR2抗體（abcam，批號：ab180953），Anti-TRPV1抗體（NOVUS，批號：NB100-1617），卵清蛋白（Sigma-Aldrich，A5378），氫氧化鋁凝膠（Thermo Fisher），百花牌蜂蜜（1000 g/瓶，北京百花蜂業科技發展股份公司），金鑼精致豬油（1000 g/桶，新程金鑼肉制品集團有限公司），56%vol紅星二鍋頭白酒（500 mL/瓶，北京紅星股份有限公司）。

人工氣候箱：PVC材質，大小100 cm×40 cm×40 cm。內含風暖加熱器2支（氣候箱兩側，對吹），加濕器1個（開口位于氣候箱中間），溫度計1支，中間由金屬網（直徑1.5 mm，不銹鋼）平均分成5格（每格里放5只大鼠+食盒水盒），內設智能溫控、濕控，箱體下部裝金屬網將大鼠托起，底部放置糞便托盤，內鋪墊料。

2 方法

2.1 模型建立、分組及給藥

采用(改良食管十二指腸側側吻合術+腹腔蛋白注射）+內外因濕熱干預法建立GERD脾虛濕熱證大鼠模型。疾病造模參照文獻[4]，證候造模參照文獻[5-6]。術后第5天注射（卵清蛋白30 mg+氫氧化鋁凝膠10 mg）/mL混勻液1 mL，假手術組注射生理鹽水1 mL。術后第8天，模型組隔日喂食，每次足量喂食，蜂蜜水（200 g/L）自由飲用，隔日以10 g/kg標準根據大鼠體質量油脂灌服，隔日再以10 mg/kg標準灌服白酒，共14天，于手術后第17天將模型大鼠放在溫度為（32±2）℃，濕度為95%的人工氣候箱中，共5天。假手術組大鼠術后第8天予蒸餾水灌胃，連續14天。

模型評價后，隨機分為5組，分別為模型組（Model）、奧美拉唑組(OM)、健脾清化顆粒低劑量組(JPQH-L)、中劑量組(JPQH-M)、高劑量組((JPQH-H)，每組12只。按照健脾清化顆粒成人每日處方量計算大鼠給藥劑量。模型組建立完成后次日根據組別給藥，按照10 mL/kg灌胃。健脾清化低、中、高劑量組給藥濃 度 分別為0.193、0.385、0.770 g/100 g，1次/日。奧美拉唑組：按照成人劑量20 mg/日計算，按照大鼠10 mL/kg灌胃，奧美拉唑灌胃濃度為0.417 mg/100 g。假手術組(Sham)按照大鼠10 mL/kg計算，每日蒸餾水灌胃。

2.2 一般行為學評價

2.2.1體重測量

各組大鼠在給藥前、給藥14天稱重，比較給藥前后大鼠的體重變化差異。

2.2.2進食量的確定

各組大鼠在給藥前、給藥14天稱重，比較給藥前后大鼠的體重變化差異。早上8-9點給予一定量飼料，隔日早上8-9點測定剩余飼料量。兩次天平稱重，比較前后差值除以大鼠數量計算出每只大鼠平均進食量。

2.2.3肛溫測定

兩屆馬薩諸塞州州長，不僅讓杜卡基斯成為第二位希臘裔美國州長，還使他成為馬薩諸塞州任期最長的州長。大選中他僅僅獲得10個州和哥倫比亞特區的選舉人票，輸給了前副總統布什。敗選后杜卡基斯繼續擔任馬薩諸塞州州長直到1991年初。后成為美國鐵路公司董事會董事，同時受聘東北大學(Northeastern University)政治學教授、洛約拉馬利蒙特大學(Loyola MarymountUniversity)政治學系客座教授以及加州大學洛杉磯分校(UCLA)公共事務學院公共政策系客座教授。沃爾特·蒙代爾WalterMondale

各組大鼠給藥前、給藥14天于上午9點測量，肛溫計測量大鼠肛溫，每只大鼠測2次，取平均值。

2.2.4糞便含水量的測定

收集的24小時糞便，稱重記錄糞便濕重。后用烘干機將糞便烘干，稱重，記錄糞便干重。糞便含水量（%）=糞便（濕重-干重）/糞便濕重×100%。

2.3 取材

藥物干預第14天灌胃完成后，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉后固定，上腹部正中線行2-3 cm切口，使胃部暴露，結扎幽門與十二指腸結合部，腹腔關閉。于60 min后處死大鼠，暴露腹腔，結扎賁門部后摘取全胃。剪開胃部，將胃內容物倒入離心管中，離心15 min后，檢測上清液成分。腹主動脈取血，離心取上清液，放入液氮中后轉入-80℃冰箱保存。取食管組織（賁門上1 cm左右），用生理鹽水清洗，放入福爾馬林固定液或轉入-80℃冰箱保存。

2.4 HE染色

大鼠食管黏膜組織石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇水化，蘇木素染色10 min，沖洗，伊紅染色5 min，脫水，透明，封片。

2.5 甲苯胺藍染色

切片，脫蠟水洗，甲苯胺藍染色30 min，沖洗，脫水，透明，封片。在光鏡200倍視野下拍照，在400倍視野下每張切片隨機選取3個食管黏膜部位進行觀察并計數。

2.6 免疫組化檢測食管黏膜組織中MCT、PAR2、TRPV1的表達

大鼠食管黏膜組織石蠟包埋切片，水洗；抗原修復，內源性過氧化氫酶封閉液室溫孵育，PBS沖洗；滴加山羊血清封閉液60 min，PBS沖洗；滴加一抗，4℃過夜，PBS沖洗；滴加二抗孵育60 min，PBS沖洗，加入顯色液至顯色后終止，蘇木素復染，PBS沖洗，脫水，透明，封片。每張切片在200倍視野下拍照，在400倍視野下每張切片隨機選取3個食管黏膜部位進行觀察，應用image J對圖片上棕黃色陽性區域MOD值進行分析。

2.7 統計學方法

3 結果與分析

3.1 一般行為學指標

3.1.1各組大鼠用藥前后體重變化

給藥前與假手術組比較，模型組及各給藥組體重顯著降低（P＜0.01）。給藥后與模型組比較，各給藥組體重均顯著增加（P＜0.01）。對各組給藥前后值變化進行比較，健脾清化顆粒低、中、高劑量組、奧美拉唑組體重顯著增加，均高于模型組（P＜0.01）；與奧美拉唑組比較，健脾清化顆粒中、高劑量組體重顯著增加（P＜0.01）（表1）。

表1 各組大鼠體重比較（xˉ±S，g）

3.1.2各組大鼠用藥前后進食量變化

給藥前與假手術組比較，模型組及各給藥組體重顯著減少（P＜0.01）。給藥后與模型組比較，各給藥組進食量均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。對各組給藥前后值變化進行比較，健脾清化顆粒低、中、高劑量組、奧美拉唑組進食量顯著增加，均高于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；與奧美拉唑組比較，健脾清化顆粒中、高劑量組進食量顯著增加（P＜0.01）（表2）。

表2 各組大鼠進食量比較（xˉ±S，g）

3.1.3各組大鼠給藥前后肛溫比較

給藥前與假手術組比較，模型組及各給藥組肛溫顯著升高（P＜0.01）。給藥后與模型組比較，各給藥組肛溫均低于模型組，健脾清化顆粒中、高劑量組顯著降低（P＜0.05）。對各組給藥前后肛溫變化進行比較，與模型組比較，健脾清化顆粒中、高劑量組顯著降低（P＜0.05）；與奧美拉唑組比較，健脾清化顆粒中劑量肛溫顯著降低（P＜0.05）（表3）。

表3 各組大鼠肛溫比較（xˉ±S，g）

3.1.4各組大鼠給藥前后糞便含水量比較

給藥前與假手術組比較，模型組及各給藥組顯著升高（P＜0.01）。給藥后與模型組比較，各給藥組糞便含水量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。對各組給藥前后糞便含水量變化進行比較，與模型組比較，健脾清化顆粒低、中劑量組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與奧美拉唑組比較，健脾清化顆粒中劑量組顯著降低（P＜0.05）（表4）。

表4 各組大鼠糞便含水量比較（xˉ±S，g）

3.2 HE染色觀察各組大鼠食管黏膜組織病理學結果

光鏡下觀察各組大鼠食管黏膜：假手術組大鼠食管黏膜表面較平整，粘膜表面復層鱗狀上皮光滑，黏膜下組織致密，基底細胞形態正常。模型組大鼠食管黏膜組織水腫，上皮細胞欠平整，基底細胞增生，排列不整齊，乳頭肌延長可達黏膜上皮厚度的2/3，存在炎性細胞浸潤。健脾清化顆粒各劑量組、奧美拉唑組大鼠食管黏膜損傷的情況均有一定程度的恢復，以高劑量組恢復最為明顯（圖1）。

圖1 各組大鼠食管黏膜組織病理學結果（HE×200）

3.3 甲苯胺藍染色觀察各組大鼠食管黏膜MCs

光鏡下觀察食管黏膜固有層、黏膜下層可見散在的MCs，呈橢圓形或梭形，胞質內含有藍紫色顆粒。MCs脫顆粒后可見胞膜邊界模糊，性狀不規則，胞質呈空泡狀或染色變淺。對各組大鼠食管黏膜MCs進行計數。結果見表5，與假手術組比較，模型組顯著增多（P＜0.01），健脾清化顆粒各劑量組及奧美拉唑組與模型組比較顯著減少（P＜0.01），各給藥組比較無統計學意義（P＞0.05）（表5、圖2）。

圖2 各組大鼠食管黏膜MCs染色結果（×200）

表5 各組大鼠食管黏膜MCs計數（xˉ±S，n）

3.4 各組干預后大鼠食管黏膜MCT、PAR2、TRPV1表達情況

MCT、PAR2、TRPV1在各組大鼠食管黏膜組織中均有廣泛黃染，黃染部分即陽性表達。結果見表6，與假手術組比較，模型組MCT、PAR2、TRPV1MOD值升高（P＜0.01），與模型組比較，各給藥組大鼠均降低（P＜0.05或P＜0.01），各給藥組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表6、圖3、圖4、圖5）。

圖3 各組大鼠食管黏膜MCT表達（×200）

圖4 各組大鼠食管黏膜PAR2表達（×200）

圖5 各組大鼠食管黏膜TRPV1表達（×200）

表6 各組大鼠食管黏膜MCT、PAR2、TRPV1表達比較（±s）

表6 各組大鼠食管黏膜MCT、PAR2、TRPV1表達比較（±s）

注：與假手術組比較，1)P＜0.01；與模型組比較，2)P＜0.05，3)P＜0.01。

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4 討論

GERD病機具有復雜性，約30%接受PPIs治療的GERD患者仍然存在臨床癥狀[7]。其中，以非糜爛性反流病（Non-erosive reflux disease，NERD）所占比例最高[8]。內臟敏感性增高是臨床治療的難點之一，其發病機制仍不明確，目前尚缺乏有針對性的特效藥物。既往研究報道了內鏡陰性的GERD仍存在食管黏膜微觀結構的改變，如食管黏膜阻抗降低，炎性細胞活化等[9-10]。因此，內臟敏感性增高可能與炎性因子、神經肽釋放增加引起神經末梢的敏化和內臟感覺閾值降低有關。當傷害性信號由外周向中樞的傳導增強，進而投射到大腦皮層引發癥狀[11]。TRPV1在消化道的表達上調能夠增加黏膜對刺激的感受性，此外，MCs是功能性胃腸病內臟高敏感機制的重要效應細胞[12]。有學者研究發現，GERD患者食管遠端黏膜出現MCs增殖活化現象，使得胞內的特異性酶——MCT釋放增加，與本研究的結果一致。MCT的釋放將進一步激活食管上皮的PAR2，促進傷害性感受器TRPV1的表達，增強食管黏膜對刺激的感受性，引起不適癥狀[13-14]。

中醫認為該病病機多虛實夾雜，初病在胃，久病及脾。脾虛為“本”，氣滯、郁熱、濕熱為“標”。脾虛為關鍵，從“脾”論治在臨床中收到了良好的效果[15-18]。脾虛一方面表現為運化不利，影響胃之順降，則水反為濕，谷反為滯，壅滯中焦，日久化熱，形成濕熱實邪反傷脾胃；另一方面脾虛肝木乘之，中焦氣機升降失常，郁而化火，與濕搏結，易形成濕熱、痰火。以現代醫學視角來看，脾胃濕熱體現在免疫系統、神經系統、胃腸動力、微生態等多方面功能的異常，突出表現為免疫調節動態失衡，機體炎癥反應增加等[19-20]。

健脾清化顆粒是唐旭東教授在董建華“通降理論”指導下的臨床經驗方，具有健脾清熱、化濕和胃降逆之功效。全方由黨參、蒼術、黃連等11味藥物組成，其中，黨參味甘、性平，歸脾、肺經，擅于益氣健脾。《本草正義》云：黨參能“健脾運而不燥，滋胃陰而不濕……鼓舞清陽，振動中氣，而無剛燥之弊。”蒼術味辛、苦，性溫，歸脾、胃經，擅于燥濕運脾。《珍珠囊》云：蒼術能“健胃安脾，諸濕腫，非此不能除。”黃連味苦，性寒，歸心、肝、胃、大腸經，擅于清熱燥濕。《珍珠囊》云：黃連能“祛中焦濕熱。”課題組前期開展多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照的RCT研究證實健脾清化顆粒可以改善GERD癥狀，減少PPIs的劑量且能夠提高患者的生活質量[21]。

本實驗采用改良食管十二指腸側側吻合術+內外因濕熱干預建立GERD病證結合大鼠模型，在造模過程中控制了食管十二指腸吻合口的大小，既保留了反流的病理機制，又能夠減少食管黏膜糜爛程度。通過觀察遠端食管黏膜MCs數量和活化情況，以及PAR2、TRPV1表達水平來進一步評價健脾清化顆粒對于食管高敏感的關鍵效應細胞的干預機制。實驗結果表明，與假手術組比較，GERD脾虛濕熱證大鼠體重、進食量減少，肛溫、糞便含水量增加，食管黏膜形態學觀察發現大鼠食管黏膜可見明顯基底層細胞增生，炎性細胞浸潤、乳頭肌延長，細胞間隙疏松等形態學改變，符合了GERD脾虛濕熱證的特征。甲苯胺藍MCs染色發現大鼠食管黏膜MCs顯著增多,健脾清化顆粒能夠增加模型大鼠體重和進食量，降低肛溫和糞便含水量，改善食管黏膜的炎癥狀態。同時，能夠減少食管黏膜MCs數量，減輕其活化脫顆粒及MCT的釋放，下調PAR2、TRPV1的蛋白表達水平，從而進一步抑制神經元的興奮，降低食管高敏感。

綜上所述，在GERD脾虛濕熱證模型大鼠的食管黏膜中可見MCs活化脫顆粒現象明顯，MCT釋放增多、同時PAR2、TRPV1蛋白表達增加。健脾清化顆粒通過減少MCs脫顆粒，下調MCT、PAR2、TRPV1的表達，從而發揮降低食管高敏感的作用。上述結果可能為中醫藥治療GERD食管高敏感的新靶點提供一定的證據，然而MCs活化所引起的食管高敏感機制尚未完全清楚，尚有待于進一步研究。