接緒二天湯對橋本甲狀腺炎小鼠卵巢儲備功能的影響＊

強玲俠，陸 華，楊 茜，李方遠，張 琦，蘇先芝，黎欣韻

（成都中醫藥大學臨床醫學院 成都 610075）

橋本甲狀腺炎又稱為自身免疫性甲狀腺炎（HT），是一種器官特異性自身免疫性疾病，其已成為一個全球公共衛生問題。全球患病率約為10-12%，影響了10倍以上的婦女[1-2]。在我國，HT的發病率為0.4-1.5%，約占甲狀腺疾病的22.5%[3]，其中抗甲狀腺過氧化物酶（TPOAb）陽性率為10.19%，抗甲狀腺球蛋白（TgAb）陽性率為9.7%[4]。男女患病比為1∶（8-9），高發年齡在30-50歲[5]。橋本甲狀腺炎是一種慢性炎癥，同時伴有三級淋巴濾泡的發育和TPOAb和TgAb的循環自身抗體濃度的增加[6]。盡管女性流行的原因尚不清楚，但可以從女性性激素的作用中找到可能的解釋。橋本甲狀腺炎不僅是甲減的危險因素，還可伴發其他自身免疫性疾病，增加甲狀腺腫瘤風險，對女性生殖健康也有影響[7]。

妊娠婦女甲狀腺自身抗體陽性可以導致多種不良妊娠結局，如早產、流產等[8]。因而，生殖功能衰竭與HT的關系引起了廣泛的關注[9]。近年來發現HT與反復著床失敗有關[10]。HT改變子宮內膜容受性及子宮內膜腺體數量從而影響著床[11-13]。卵巢中存在甲狀腺激素受體，故甲狀腺激素對卵巢功能維持起重要作用[14]。卵巢是自身免疫性疾病中自身免疫攻擊的目標，可損害卵巢功能和卵巢儲備能力，具體機制尚不清楚。Chen等[15]表明中國女性特發性低卵巢儲備與更頻繁的TPOAb陽性相關，但與TPOAb水平無關；與甲狀腺功能或TgAb陽性無明顯相關性。Ko?ir Poga?nik等[16]發現HT組與對照組相比TPOAb、TgAb水平顯著增加，同時證明HT和POI之間有相關性。

目前常用治療方法多為發展至甲狀腺功能減退癥時予以口服左甲狀腺素鈉片及微量元素補充等，中醫從肝脾腎三臟辨證論證此病。但尚未發現使用中藥治療對卵巢的影響的相關研究。本文通過動物實驗探究中藥對橋本甲狀腺炎雌鼠卵巢功能的影響以減少不良妊娠發生，希望對臨床工作提供新思路。

1 材料

1.1 實驗動物

昆明小鼠，雌性，8-9周齡，60只，體重20-30 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供（許可證號：SCXK（川）2020-030），飼料由成都達碩實驗動物有限公司提供。飼養地點和實驗單位為成都中醫藥大學SPF級婦科實驗動物中心（SYXK（川）2019-049）。飼養環境通風良好，溫度保持在20-24℃。

1.2 藥物與試劑

實驗所需藥物如下：豬甲狀腺球蛋白pTg（上海經科生物，JKH0040）；弗氏不完全佐劑（IFA SIGMA，F5506-10X10ML）；弗 氏 完 全 佐 劑（CFA SIGMA，F5881-10X10ML）；磷 酸 鹽 緩 沖 液PBS（biosharp，1XPBS緩沖液）；碘化鈉晶體（科密歐，Q/12HB 3847-2012）；蒸餾水、接緒二天湯等。試劑配制：①高碘水:將0.64 g碘化鈉晶體與1 L蒸餾水混合，配成濃度為0.64 g·L-1的高碘水；②抗原溶液:將甲狀腺球蛋白pTg抗原（1 mg/mL）溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）中；③初次免疫乳化劑:將弗氏完全佐劑和抗原溶液以1∶1體積比分別吸入2個注射器中，2個注射器交替推動，直至形成黏稠的乳化劑為止，使其最終濃度達500 mg·L-1，現配現用；④加強免疫乳化劑：將弗氏不完全佐劑和抗原溶液以1∶1體積比，如同初次免疫乳化劑制備方法，制備成500 mg·L-1的油包水乳狀液；⑤中藥制備：接緒二天湯由黃芪、淫羊藿、仙茅、艾葉組成，是陸華研究員自擬常用方。藥物1劑合計46 g生藥，人臨床用量為1日1劑，按平均體重50 kg計算，相當于0.92 g生藥·kg-1。實驗過程中采用顆粒劑型，由華潤三九醫藥股份有限公司制備。

1.3 主要儀器

病理切片：Leica ASP200S型全封閉自動脫水機、Thermo HistoStar自動包埋機、Thermo HM340旋轉切片機、Thermo Shandon Gross-Star臺式病理取材臺、Leica全自動染色機。血清檢測：電子分析天平（瑞士PRECISAXB220A）、組織研磨儀器HF-48（上海凈帆）、電熱恒溫培養箱(武漢一恒蘇凈科學儀器;37度)、冷凍離心機（TGL16M臺式高速冷凍離心機）、酶標儀（Rayto，RT-6100）、洗板機（Tianshi，988洗板機）、大龍0-1 mL單道移液槍、eppendorf 50-200 μL單道移液槍、eppendorf 0.5-10μL單道移液槍、大龍0-300μL八道排槍、TSH（210640M）及TgAb（210658M）、TPOAb（210609M）、FT3（210677M）、FT4（210676M）、AMH（210604M）、E2（210611M）、P（210668M）ELISA檢測試劑盒（廠家均為：江蘇酶免）。

2 方法

2.1 動物模型建立

參考經典的抗原免疫誘導造模同時[17-19]，給予高碘環境，結合兩種方法模擬自身甲狀腺疾病，建立更接近臨床癥狀的小鼠模型。將60只昆明雌鼠分為對照組、模型組、中藥干預組各20只，每組又隨機分組2個亞組（取材組10只、合籠組10只），適應性喂養1周后進行造模。第2周開始造模時予以高碘水喂養。除對照組外，其余2組小鼠于皮下（頸部、背部、大腿內側、腹部等）多點注射含PTg（0.5 mg·mL-1）完全弗氏佐劑抗原共0.2 mL，連續2周，每周兩次；第3周起每只小鼠皮下注射PTg（0.25 mg·mL-1）不完全弗氏佐劑抗原0.2 mL，連續9周，每周兩次；共11周結束造模，后繼續以高碘水喂養直至15周。對照組按照等量PBS緩沖液進行多點皮下注射11周。按照體表面積換算法，人和小鼠的藥物劑量換算比值，中藥干預組從造模第9周開始以給藥濃度32.5 mg/ml的接緒二天湯灌胃，5次/周，1次/日至15周；對照組與模型組灌胃給予等量生理鹽水灌胃，灌胃周期同上。

2.2 標本采集

干預結束后，于造模15周各組取材組小鼠均選擇動情前期取材。按用10%水合氯醛按0.4 mL/100 g進行腹腔注射麻醉，麻醉后眼眶采血，室溫靜置20 min后，以3000 r/min離取血清，分裝后-80℃待測。酒精消毒小鼠頸部，分離氣管并剝離甲狀腺，去除筋膜和結締組織；沿下腹中線剪開，沿著陰道口尋找大鼠的“Y”字型子宮，沿著子宮的兩個角向上尋找到左右卵巢，小心剝離子宮及卵巢周圍脂肪組織，稱取子宮、卵巢濕重后放入EP管，液氮速凍，-80℃待測。一側卵巢用于冰凍切片HE染色，另一側卵巢組織以備其它檢測。

2.3 觀察指標及檢測指標

每周觀察并記錄每組小鼠體重、毛色、活動狀態、排泄情況、飲水攝食情況、死亡情況、肛溫等并詳細記錄實驗過程中出現的異常情況。ELISA法檢測促甲狀腺激素（TSH）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺激素（FT4）、抗甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）、抗甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）、雌激素（E2）、孕酮（P）、抗繆勒管激素（AMH）等以探討接緒二天湯對橋本甲狀腺炎雌鼠卵巢功能的影響。合籠組小鼠以雌雄2∶1比例進行合籠，計數產仔總數及子代存活數。

2.4 統計方法

所有統計分析將采用SPSS 25.0統計分析，對照組-模型組、對照組-中藥干預組比較使用單因素ANOVA進行比較分析。事后多重比較：假定方差齊性選擇“LSD”，未假定方差齊性選擇“Tamhane's T2”，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況

與對照組相比，模型組小鼠從第9周開始出現飲水攝食欠佳，行動較遲緩，毛發稀疏有脫落現象，肛溫較低，體重較輕，開始出現死亡現象，身體有不同程度皮下潰爛，同時伴有不同程度大便稀糖表現；與模型組相比，中藥干預組小鼠一般情況有所改善，體重、飲水攝食有所增加，皮膚及毛發情況較好，首次死亡出現在第10周且死亡總數較少，經中藥干預后大便情況明顯好轉。

3.2 模型評估

對照組小鼠甲狀腺細胞排列布局整齊，濾泡橢圓形，染色呈淡紅，無異常浸潤。模型組甲狀腺鏡下可見大小不均勻的甲狀腺濾泡，濾泡上皮呈扁平狀，濾泡內可見嗜伊紅膠質，嗜酸性（紅染），膠質厚薄不一；可見中度程度淋巴細胞聚集，灶性濾泡破壞。中藥干預組甲狀腺可見大小不均勻的甲狀腺濾泡，濾泡上皮呈低立方狀，濾泡內可見嗜伊紅膠質，嗜酸性（紅染），膠質厚薄不一；可見輕度淋巴細胞聚集，灶性濾泡破壞。甲狀腺病理切片結果說明橋本甲狀腺炎模型建立成功。

造模第7周開始出現喬甲炎特征，卵巢出現炎性表現趨勢。于造模第9周發現喬甲炎特征趨向典型表現，卵巢慢性炎癥較前明顯，檢測發現卵巢貯備功能有下降趨勢。病理結果證明：喬甲炎可影響卵巢功能，導致儲備功能下降。

3.3 對甲狀腺的影響

造模后，模型組雌鼠血清TgAb、TPOAb明顯高于對照組（P＜0.01），差異有統計學意義；3組血清TSH、FT3、FT4值均處于正常值范疇，差異無統計學意義（表1）。

表1 各組血清TSH、FT3、FT4、TgAb、TPOAb比較（±s，n=8）

表1 各組血清TSH、FT3、FT4、TgAb、TPOAb比較（±s，n=8）

注：對照組與模型組比，**P＜0.01；對照組與中藥干預組比，△△P＜0.01；模型組與中藥干預組比，▲▲P＜0.01。

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3.4 對卵巢的影響

圖1 各組小鼠甲狀腺病理形態學變化（HE染色,×200）

圖2 各組小鼠卵巢病理形態學變化（HE染色，×200）

與模型組相比，中藥干預組血清E2、P升高（P＜0.05）、血清AMH明顯升高（P＜0.01），差異有統計學意義（表2）。

表2 各組血清E2、P、AMH比較（±s，n=8）

表2 各組血清E2、P、AMH比較（±s，n=8）

注：對照組與模型組比，**P＜0.01；對照組與中藥干預組比，△P＜0.05，△△P＜0.01；模型組與中藥干預組比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

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中藥干預組原始卵泡計數較模型組明顯增加（P＜0.01），初級卵泡、次級卵泡及黃體數均增加（P＜0.05），閉鎖卵泡減少（P＜0.05），差異有統計學意義；成熟卵泡差異無統計學意義（表3）。

表3 各組卵巢各級卵泡計數比較（±s，n=8）

表3 各組卵巢各級卵泡計數比較（±s，n=8）

注：對照組與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01；模型組與中藥干預組比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

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與模型組相比，中藥干預組卵巢濕重增加（P＜0.05）；產仔總數增加（P＜0.05），存活數明顯增加（P＜0.01），差異有統計學意義（表4）。

表4 各組子代數、存活數、卵巢濕重比較（±s，n=8）

表4 各組子代數、存活數、卵巢濕重比較（±s，n=8）

注：對照組與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01；對照組與中藥干預組比，△△P＜0.01；模型組與中藥干預組比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

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3.5 陽虛證型評價

與模型組相比，中藥干預組小鼠體重從造模11周開始明顯增加（P＜0.05），差異有統計學意義（表5）。

表5 各組小鼠靜息狀態下肛溫（℃）

與模型組相比，中藥干預組小鼠肛溫從造模11周開始明顯增加（P＜0.05），差異有統計學意義（表6）。

表6 各組小鼠體重增長情況（g）

4 討論

結合本病特征，當屬傳統醫學的“癭病、虛勞”范疇。病因多為飲食水土失宜或先天體質、情志失調等。有學者指出：腎氣先天不足，脾氣后天失養為發病之本。疾病發展中以情志失和為誘因，肝郁化火傷陰可見陰虛諸證，病情遷延日久可致陰損及陽，最終可見脾腎陽虛諸證。故大多醫家將本病發展分為肝郁化火、肝郁脾虛、脾腎陽虛3個階段[20-22]。臨床中多結合此分期對癭病進行辨證論治。

在以往的報道中，腎陽虛與脾陽虛模型的癥狀表現基本一樣，都有精神萎靡、倦怠少動、毛枯不榮、體重下降及體溫降低等表現[23]。接緒二天湯是導師根據行醫多年經驗自擬常用方劑，外用及內服均可發揮作用。本方由黃芪、淫羊藿、仙茅等組成，致力于溫補脾腎。經中藥干預后小鼠體重增加（P＜0.05）、肛溫上升（P＜0.05）、大便情況好轉、皮膚及毛發情況改善可佐證藥物對癥并有效。從所表現的體重和體溫下降及其該中藥具有溫補脾腎功效佐證，提示該模型有脾腎陽虛的病生理變化，具體尚需進一步研究。

結合國內外文獻及我們前期預實驗發現橋本甲狀腺可以影響雌鼠卵巢功能。①從藥物組成而言：淫羊藿的主要活性成分為淫羊藿苷，可促進雌二醇、孕激素分泌，改善內分泌水平[24]。淫羊藿苷也可以促進衰老小鼠卵泡發育，抑制卵泡閉鎖，上調E2和AMH水平，減輕卵巢損傷，提高生育力[25-26]。黃芪補氣健脾，淫羊藿補腎壯陽，兩者相使為用共資先后天之本。仙茅及艾葉中含有黃酮類成分，現代藥理研究表明其具有雌激素樣作用。②從中醫理論出發：腎藏精，主生殖，是人體生長發育、生殖的根本，精又為化血之源，直接為胞宮提供物質基礎；脾為氣血生化之源，胞宮的孕、產、育都以血為用，四藥協同對腎-天癸-胞宮-沖任軸起到調節作用。③實驗結果顯示中藥干預組原始卵泡計數、初級卵泡、次級卵泡及黃體數較模型組均增加（P＜0.05或P＜0.01），血清E2、P、AMH升高（P＜0.05或P＜0.01），卵巢濕重、產仔總數、子代存活數均增加（P＜0.05或P＜0.01），送檢卵巢組織中藥干預組較模型組炎癥明顯減輕，從而說明接緒二天湯對橋本甲狀腺炎引起的卵巢損害有改善作用。

目前公認橋本甲狀腺炎是一種自身免疫性疾病，國內外研究以發現其作用機制為主，研究其對子宮的影響較多，相對缺乏其對卵巢影響的研究。并且臨床未發展至甲減前未行相關系統的干預，也未發現特效藥物。目前多項研究發現其對妊娠的不良影響，故必須探尋有效的干預措施。現有的治療多以口服維生素、微量元素及左甲狀腺素鈉片為主，臨床存在依從性差、心理抵觸等問題。現在醫療發展中越來越重視中醫藥文化，更多的育齡期婦女選擇孕前、孕中行中醫調理及保胎治療，對中醫藥有了更多的依賴。而目前對于HT引起的卵巢損害治療很少使用中藥，但其對育齡期婦女生殖相關影響不得不防，所以中藥作用日益凸顯，因而中藥的動物實驗研究對臨床工作至關重要。故本實驗研究中藥對卵巢的作用，希望找到治療此病的有效方法。現有研究鳳毛麟角，本次實驗屬于小樣本研究，尚缺乏精心設計的動物實驗來闡明其作用機制而且小樣本實驗存在誤差，僅對此病治療提供思路。后期會再進行實驗詳細分析及研究藥物機制，為中醫藥臨床工作提供可行性證據。