基于津液理論探討改良枳術(shù)方對(duì)便秘大鼠AQP3/AQP9、MUC2的影響＊

聞 永，占 煜，魏先鵬，唐學(xué)貴＊＊

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 瀘州 646000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 成都 610000；3.成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 成都 610000；4.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 南充 637000）

便秘是一種常見的胃腸道疾病，也是多種疾病的常見癥狀，其中以慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)臨床較為常見。便秘不僅誘發(fā)肛周疾病，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，同時(shí)與心腦血管意外等致死致殘性疾病密切相關(guān)[1-2]。因此便秘的有效防治至關(guān)重要。但慢性便秘的機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為可能與以下因素相關(guān)：遺傳、生活方式、心理行為因素、腸道運(yùn)動(dòng)功能等，發(fā)病機(jī)制研究多集中于腸神經(jīng)系統(tǒng)、Cajal間質(zhì)細(xì)胞、腸神經(jīng)遞質(zhì)、結(jié)腸平滑肌、腸道菌群以及microRNA、孕酮、甲烷、水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)等[3]，目前尚無普遍的共識(shí)。因此導(dǎo)致了現(xiàn)有的便秘治療手段以對(duì)癥治療為主，遠(yuǎn)期療效差，而手術(shù)治療也存在創(chuàng)傷大，療效不確切的風(fēng)險(xiǎn)，急需一種安全有效的便秘治療方法。

中醫(yī)藥作為我國特色醫(yī)療資源寶庫，在慢性便秘防治中優(yōu)勢(shì)明顯，但是缺乏系統(tǒng)的理論和作用機(jī)制研究，限制了其臨床推廣應(yīng)用。課題組在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上，提出從脾論治便秘，篩選出經(jīng)典名方枳術(shù)丸，并適當(dāng)化裁為改良枳術(shù)方，臨床應(yīng)用取得良好療效[4]，其作用機(jī)制可能與調(diào)控結(jié)腸AQPs影響結(jié)腸水分代謝相關(guān)[5-6]。在此基礎(chǔ)上我們?cè)凇按竽c主津”理論下進(jìn)一步明確了AQP3/AQP9介導(dǎo)的結(jié)腸水分代謝在便秘發(fā)生中的重要作用。近期胃腸道粘液層功能受到廣泛關(guān)注，其與炎癥免疫，腸道動(dòng)力障礙等關(guān)系密切[7-8]。已有研究證實(shí)，黏蛋白2(Mucin 2，MUC2)表達(dá)降低，腸道粘液的減少與便秘發(fā)生密切相關(guān)[9]。受此啟發(fā)，我們以中醫(yī)傳統(tǒng)津液理論為指導(dǎo)，結(jié)合津液既有相同又有不同的特點(diǎn)，創(chuàng)新性提出結(jié)腸AQP3/AQP9、MUC2介導(dǎo)的結(jié)腸水分和粘液與中醫(yī)學(xué)的“津”“液”相吻合，兩者的代謝異常可能與便秘發(fā)生密切相關(guān)，而改良枳術(shù)方正是通過調(diào)控津液代謝異常發(fā)揮通便作用，因此本研究作為課題的一部分，擬使用改良枳術(shù)方干預(yù)STC模型大鼠，觀察大鼠結(jié)腸AQP3/AQP9、MUC2表達(dá)的變化，以進(jìn)一步明確改良枳術(shù)方的作用機(jī)制，擴(kuò)展津液理論現(xiàn)代詮釋。

1 材料與方法

清潔級(jí)Wistar大鼠48只，雄性，體質(zhì)量230±30 g，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)，川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2018-076。飼養(yǎng)條件：獨(dú)立飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境室溫(24±2℃)、55±5%濕度、明暗各12 h(人工照明：08:00-20:00)、24 h自由飲水、噪音＜60 dB，飼料、墊料均來自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥品

改良枳術(shù)方免煎顆粒配方枳實(shí)、白術(shù)藥物來源于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥房，江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；鹽酸洛哌丁胺膠囊(西安楊森制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H10910085)；枸櫞酸莫沙必利分散片(成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20031110)。

1.3 主要試劑及儀器

多聚甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；二甲苯(成都科龍化工試劑廠)；蘇木素(北京百靈威科技有限公司)；檸檬酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Solarbio);MUC2兔單克隆抗體(ABcam公司)；AQP9兔多克隆抗體(Affinity)；AQP3兔多克隆抗體(ABcam公司)；生物素二抗山羊抗鼠/兔工作液(北京中杉金橋生物有限公司);正常山羊血清(北京中杉金橋生物有限公司);濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)。

轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(徠卡-2016，德國)；TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)等；圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀5200(上海天能科技有限公司)。

1.4 模型制備

使用洛哌丁胺灌胃制備慢傳輸便秘模型，參照課題組既往及其他文獻(xiàn)[10-11]，配制1 mg/mL洛哌丁胺混懸液，按10.0 mg/kg的劑量灌胃，bid，連續(xù)30天，空白組予等量蒸餾水灌胃。造模期間予大鼠正常進(jìn)食飲水。除空白組外，其余各組均給予洛哌丁胺建立慢傳輸型便秘大鼠模型。以糞便含水量、腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間驗(yàn)證造模是否成功。

1.5 分組及給藥

將48只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，即：空白組，模型組，莫沙必利組、改良枳術(shù)方低、中、高劑量組，造模成功后，各治療組分別給予相應(yīng)藥物灌胃治療。其中改良枳術(shù)方以枳實(shí)15 g、白術(shù)30 g為低劑量、枳實(shí)15 g、白術(shù)60 g為中劑量、枳實(shí)15 g、白術(shù)90 g為高劑量，按照人與動(dòng)物劑量換算，低、中、高劑量組大鼠分別給予4.725、7.875、11.024 g/(kg·d)灌胃，莫沙必利組以1.56 mg/(kg·d)莫沙必利混懸液灌胃，空白組和模型組灌胃等劑量的蒸餾水。每天一次，共持續(xù)7天。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1糞便含水量及24 h排便粒數(shù)

造模結(jié)束(即最后一次洛哌丁胺灌胃)后，分別將大鼠放入代謝籠中，收集每組大鼠24 h糞便并計(jì)數(shù)，然后用電子天平分別稱其重量為濕重(W1)，后置于60℃溫箱中干燥12 h后稱其干重(W2)，按下面公式計(jì)算大便含水量百分比：糞便含水量＝[(W1-W2)/W1]x100%。

1.6.2腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間

每組隨機(jī)選擇3只大鼠進(jìn)行腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間測(cè)定。造模結(jié)束后3只大鼠用預(yù)先準(zhǔn)備好的10%的活性炭2 mL灌胃，記錄每只大鼠灌胃時(shí)間，每只大鼠單獨(dú)放入代謝籠中，然后觀察并記錄每只大鼠第一粒黑便排出時(shí)間，從灌胃至第一顆黑便排出時(shí)間即為腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間。

1.6.3腸道推進(jìn)率

各組大鼠處死前，隨機(jī)選擇3只大鼠，予以禁食禁水24 h后，以配制好的10%活性炭混懸液10 mL/kg灌胃，30 min后，用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后處死，打開腹腔，分離腸系膜，剪取上端至幽門，下端至回盲部全部腸管，輕拉呈直線，靜置30 s，測(cè)量應(yīng)在無張力情況下完成，測(cè)量腸管長(zhǎng)度為腸管總長(zhǎng)度L1及從幽門至炭末前沿的距離L2。腸道推進(jìn)率=(L2/L1)x100%。

1.6.4免疫組化檢測(cè)結(jié)腸AQP3、AQP9、MUC2表達(dá)

用配制好的2%戊巴比妥鈉2 mL/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，待麻醉效果滿意后,采取頸椎脫臼法處死大鼠，剪開腹部，取出結(jié)腸，切取遠(yuǎn)端結(jié)腸約2 cm，用PBS緩沖液涮洗，4%多聚甲醛固定液固定后備用。

固定組織經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水，包埋，切片、烤片、脫蠟后，將切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，微波爐中高火加熱至沸騰后斷電，間隔5 min后，反復(fù)1次，冷卻后，PBS洗2次，每次5 min；滴加山羊血清封閉液，室溫20 min；滴加一抗(AQP3、AQP9、MUC2)，4℃過夜；滴加生物素化二抗，37℃30 min；PBS水洗3次，每次5 min；使用DAB顯色試劑盒，混勻試劑后滴加到切片上，室溫顯色，鏡下控制反映時(shí)間，2 min左右，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。采用麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)顯微攝像系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先于100倍下觀察全部組織，再選取3個(gè)視野分別采集400倍顯微圖像。

1.6.5蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)腸AQP3、AQP9、MUC2表達(dá)

蛋白免疫印跡(Western Blot，WB)簡(jiǎn)要操作步驟：使用RIPA裂解液將結(jié)腸組織裂解30 min，然后離心在4℃下以12000 r/min轉(zhuǎn)速運(yùn)行10 min后取上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。隨后蛋白變性、上樣、電泳、轉(zhuǎn)模，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，TBST洗膜3次，加入一抗、二抗進(jìn)行孵育，相關(guān)蛋白的表達(dá)通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒使用凝膠成像儀進(jìn)行可視化，用天能GIS機(jī)箱控制軟件V2.0對(duì)條帶進(jìn)行曝光掃描，結(jié)果以目的蛋白相對(duì)表達(dá)量表示(目的蛋白IOD/內(nèi)參IOD)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS22.0處理分析，計(jì)量資料都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示，多組間比較符合正態(tài)分布及方差齊性的采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊，采用Dunnett’sT3檢驗(yàn)。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠一般情況

各組大鼠實(shí)驗(yàn)前均精神良好，活動(dòng)敏捷，皮毛光澤，進(jìn)食進(jìn)水量正常，排便頻次正常，大便干濕適中。本次實(shí)驗(yàn)過程中共死亡大鼠5只，除了低劑量組外，其他組分別死亡1只。死亡大鼠中2只在開始灌胃的當(dāng)天死亡，剩下3只在第2天死亡，尸檢時(shí)均發(fā)現(xiàn)肺部有血性分泌物，肺組織損傷嚴(yán)重，考慮可能是灌胃操作時(shí)大鼠固定不佳，手法不當(dāng)損傷肺部導(dǎo)致死亡，及時(shí)總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，后續(xù)未見大鼠死亡。實(shí)驗(yàn)開始后空白組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，精神狀態(tài)佳，糞便呈連續(xù)條狀。其余分組大鼠約在造模開始第7天前后開始出現(xiàn)不同程度的變化：皮毛泛黃、光澤差，精神較前差，進(jìn)食飲水減少，大便量少，糞便干硬，成顆粒狀。治療結(jié)束后，各治療組大鼠，包括模型組大鼠一般情況均有不同程度的改善，大便和進(jìn)食飲水情況也有所改善。

2.2 各組大鼠大便糞便含水量及24 h糞便顆粒數(shù)比較

各組大鼠大便糞便含水量及24 h糞便顆粒數(shù)如表1示，與空白組比，其他各組造模后糞便含水量及24 h排便粒數(shù)均明顯減少(P＜0.05)。表明洛哌丁胺造模后大便干結(jié)，排便減少，符合便秘表現(xiàn)，便秘模型成功；與模型組比，各組治療后糞便含水量及24 h糞便顆粒數(shù)均明顯增加(P＜0.05)，在莫沙必利與中藥干預(yù)各組的比較中，高劑量組和中劑量組干預(yù)后的糞便含水量明顯高于莫沙必利組(P＜0.05)，表明經(jīng)過治療后各組大鼠的便秘癥狀均得到緩解，大便變軟，排便量增加，其中改良枳術(shù)方的中高劑量的臨床療效優(yōu)于莫沙必利組，特別是在增加糞便含水量方面；各干預(yù)組中24小時(shí)糞便顆粒數(shù)未見顯著差異(P＞0.05)，表明改良枳術(shù)方和莫沙必利在增加排便量方面療效相當(dāng)。

表1 24 h糞便顆粒數(shù)和糞便含水量

2.3 各組大鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間和腸道推進(jìn)率比較

各組大鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間和腸道推進(jìn)率如表2示，與空白組比，造模后腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，表明便秘模型大鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)緩慢，符合慢傳輸便秘的病理，造模成功；與模型組比，干預(yù)后各組腸道推進(jìn)率明顯增加(P＜0.05)，與莫沙必利組比，各中藥干預(yù)組腸道推進(jìn)率增加不顯著(P＞0.05)，表明經(jīng)過無論是中藥還是西藥的干預(yù)，便秘大鼠的腸道運(yùn)動(dòng)功能均明顯恢復(fù)，但改良枳術(shù)方未能顯示出比莫沙必利更強(qiáng)的促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)能力。

表2 腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間和腸道推進(jìn)率

2.4 結(jié)腸組織AQP3、AQP9和MUC2免疫組化表達(dá)比較

各組大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP9和MUC2表達(dá)如表3及圖1示，與空白組相比，模型組大鼠腸組織MUC2蛋白含量明顯降低，AQP3蛋白含量明顯升高(P＜0.05)，表明便秘大鼠的結(jié)腸MUC2蛋白生成降低，結(jié)腸粘液減少；AQP3蛋白增加，結(jié)腸水分重吸收增多，造成腸道內(nèi)水分不足，這可能是便秘發(fā)生的機(jī)制之一；與模型組相比，高劑量組、中劑量組大鼠腸組織MUC2蛋白含量均升高(P＜0.05)，提示改良枳術(shù)方可以促進(jìn)腸道黏蛋白2的生成，增厚腸道粘液層；莫沙必利組、高劑量組、中劑量組大鼠腸組織AQP3蛋白含量均降低(P＜0.05)，高劑量組大鼠腸組織AQP9蛋白含量降低(P＜0.05)，提示改良枳術(shù)方可能通過減少AQP3、AQP9的表達(dá)，抑制其水分重吸收功能，增加腸道水分從而發(fā)揮通便作用。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP9、MUC2蛋白表達(dá)結(jié)果(×400)

表3 大鼠腸組織AQP3、AQP9、MUC2平均光密度(xˉ±SD)

2.5 結(jié) 腸 組 織AQP3、AQP9和MUC2蛋 白WB檢 測(cè)比較

各組大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP9和MUC2蛋白表達(dá)經(jīng)WB檢測(cè)，結(jié)果如圖2示，與免疫組化結(jié)果基本一致。與空白組相比，模型組大鼠腸組織MUC2含量明顯降低，AQP3含量明顯升高(P＜0.05)；與模型組相比，各干預(yù)組大鼠結(jié)腸組織MUC2含量均升高（P＜0.05），AQP3含量均降低（P＜0.05），高劑量組大鼠結(jié)腸組織AQP9含量降低（P＜0.05）。提示改良枳術(shù)方可能通過減少AQP3、AQP9的表達(dá)，增加腸道水分，同時(shí)促進(jìn)腸道MUC2的生成，增加腸道黏液分泌從而發(fā)揮通便作用。

圖2 Western blot檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP9、MUC2蛋白表達(dá)水平

3 討論

便秘的癥狀主要有自發(fā)性排便次數(shù)減少和大便的干結(jié)，也包括排便困難如排便費(fèi)力、排便不盡感、肛門直腸堵塞感、排便費(fèi)時(shí)等一系列癥狀。本實(shí)驗(yàn)中使用洛哌丁胺造模后大鼠出現(xiàn)大便干結(jié)，糞便含水量減少，排便量少，腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間延長(zhǎng)，符合便秘臨床表現(xiàn)，造模成功。

AQPs是一類具有特異孔道結(jié)構(gòu)的跨膜蛋白，也稱水孔蛋白，主要介導(dǎo)水分子和甘油分子的通透。AQPs廣泛存在于動(dòng)植物和人體的各種組織、細(xì)胞中，尤其與液體吸收和分泌有關(guān)的上皮和內(nèi)皮細(xì)胞，參與調(diào)節(jié)液體吸收、分泌和細(xì)胞內(nèi)外水平衡等與水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的生理和病理過程。因此近來不斷有報(bào)道發(fā)現(xiàn)STC發(fā)生與結(jié)腸AQPs的異常表達(dá)有關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸AQP3主要介導(dǎo)近端結(jié)腸的水分重吸收，AQP9主要介導(dǎo)遠(yuǎn)端結(jié)腸水分重吸收，兩者所介導(dǎo)的腸道水分重吸收功能失常，與便秘的發(fā)生密切相關(guān)[12-13]。本研究中也發(fā)現(xiàn)便秘模型大鼠結(jié)腸AQP3表達(dá)明顯增加，從而導(dǎo)致結(jié)腸水分被重吸收過度，糞便含水量減少，誘發(fā)便秘發(fā)生。

MUC2是腸道黏液層所有粘蛋白中最重要的黏液蛋白蛋白質(zhì)，已被證明是一種重要的對(duì)外源性病原體的保護(hù)屏障，在腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面具有多種功能。MUC2同時(shí)作為保護(hù)粘膜的潤滑劑也可以協(xié)助糞團(tuán)通過。MUC2減少和(或)黏液層厚度降低也可見于便秘患者。一項(xiàng)針對(duì)藥物性便秘大鼠的研究表明，黏液層厚度減少，可能阻礙大便通過[14]。在對(duì)洛哌丁胺誘發(fā)的便秘大鼠模型的研究表明，使用硫酸多糖誘導(dǎo)腸道運(yùn)動(dòng)能夠增加腸上皮粘蛋白(MUC2)的產(chǎn)生和粘液層的厚度，從而增加了糞便排泄。有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充復(fù)合益生菌可能通過上調(diào)MUC2基因，促進(jìn)黏蛋白分泌達(dá)到有效改善排便頻率及性狀，緩解便秘癥狀的效果[15]。另外將STC患者的糞便菌群植入偽無菌小鼠可誘導(dǎo)后者產(chǎn)生STC癥狀，且伴隨MUC2表達(dá)的顯著下降[16]。這些均說明MUC2的表達(dá)在便秘發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究中也可以看到便秘模型大鼠結(jié)腸MUC2明顯減少，導(dǎo)致腸道粘液生成不足，腸道潤滑不夠，大便通過緩慢。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢性便秘與水液代謝失常密切相關(guān)。《傷寒論》“太陽病發(fā)汗、若下、若利小便，此亡津液，胃中干燥……不更衣，內(nèi)實(shí)，大便難者”《諸病源候論》、《重訂嚴(yán)氏濟(jì)生方·秘結(jié)論治》、《蘭室秘藏·大便結(jié)燥》、《景岳全書·秘結(jié)》中均明確指出津液不足是導(dǎo)致便秘的重要原因。“津虧腸燥、大便秘結(jié)”，導(dǎo)致便秘的發(fā)生。

津液因均來自水谷精微化生，共同發(fā)揮滋養(yǎng)濡潤故兩者常常一起統(tǒng)稱，但兩者仍有不同。《靈樞·決氣》說：“腠理發(fā)泄，汗出溱溱，是謂津……谷入氣滿，淖澤注于骨，骨屬屈伸，泄?jié)裳a(bǔ)益腦髓，皮膚潤澤，是謂液”。《靈樞·五癃津液別》又說：“津液各走其道，故三焦出氣，以溫肌肉，充皮膚，為其津；其流而不行者，為液。”在津液中，質(zhì)地較清稀，流動(dòng)性較大，布散于體表皮膚、肌肉和孔竅，并能滲入血脈之內(nèi)，起滋潤作用的，稱為津；質(zhì)地較濃稠，流動(dòng)性較小，灌注于骨節(jié)、臟腑、腦、髓等，起濡養(yǎng)作用的，稱為液。《類經(jīng)·藏象類》注曰：“津液本為同類，然亦有陰陽之分。蓋津者，液之清者也；液者，津之濁者也。津?yàn)楹苟唠砝恚蕿殛枺灰鹤⒐嵌a(bǔ)腦髓，故屬陰。”具體到腸道而言我們認(rèn)為腸道內(nèi)的水分清稀流動(dòng)為“津”，腸道的粘液質(zhì)稠濡養(yǎng)為“液”，腸道津液不足導(dǎo)致便秘發(fā)生。

結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)詮釋，我們大膽設(shè)想AQP3/AQP9主要調(diào)控腸道水分代謝，符合“津”的定義，而MUC2主要調(diào)控腸道黏液的生成，黏液潤滑濡養(yǎng)，符合“液”的定義，兩者共同在便秘發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。其他研究從津液相關(guān)性也佐證了這一觀點(diǎn)，在頑固性便秘中結(jié)腸AQP9與MUC2在空間分布上和表達(dá)方式上均具有一致性，充分提示了二者在功能上密切相關(guān)，而中藥白花蛇舌草，甘草和肉桂混合物用于治療便秘，發(fā)現(xiàn)可以同時(shí)調(diào)節(jié)MUC2和AQP8[17]。在急性干眼癥中AQP5和黏蛋白5AC之間存在協(xié)調(diào)反應(yīng)，而甘草酸可以通過NF-κB途徑同時(shí)抑制組胺介導(dǎo)的人鼻上皮細(xì)胞黏蛋白5AC上調(diào)和AQP5下調(diào)[18]。這些研究均提示水通道蛋白介導(dǎo)的水分代謝和黏蛋白介導(dǎo)的黏液代謝之間存在密切的關(guān)聯(lián)，這也與中醫(yī)津液理論的津液同源可以互補(bǔ)轉(zhuǎn)化不謀而合。在本實(shí)驗(yàn)研究中也證實(shí)便秘模型組大鼠AQP3/AQP9、MUC2均有不同程度的變化，導(dǎo)致“津”“液”兩傷，誘發(fā)便秘形成，符合津液既相互協(xié)調(diào)又各有不同的特點(diǎn)。

枳實(shí)白術(shù)配伍首見于《金匱要略》：“心下堅(jiān)，大如盤，邊如旋盤，水飲所作，枳術(shù)湯主之。”方中枳實(shí)七枚，為君藥，主行氣散滯；白術(shù)二兩，為臣藥，主健脾化飲。兩者配伍，功能行氣散滯，健脾化飲。劉完素《素問病機(jī)氣宜保命集》記載了枳術(shù)丸，方中白術(shù)一兩，枳實(shí)麩炒五錢，主治“氣不下降食難消化”。李杲錄存張完素創(chuàng)立的枳術(shù)丸，初見于《內(nèi)外傷辨惑論》“易水張先生枳術(shù)丸”，《脾胃論》中更名為枳術(shù)丸。方中枳實(shí)麩炒黃去瓤一兩，白術(shù)二兩，“荷葉裹飯為丸……多用白湯下”，白術(shù)用量是枳實(shí)的兩倍，意在健脾，消食為輔；枳實(shí)麩炒，一可增其入脾胃之功，消除積滯，二可減弱辛散峻烈之性，減少對(duì)脾胃的損傷；兩藥配伍，補(bǔ)重于消，寓消于補(bǔ)，補(bǔ)脾不滯邪，祛邪不傷正。我們將其進(jìn)一步改進(jìn)，結(jié)合慢性便秘虛實(shí)夾雜的病機(jī)，加強(qiáng)補(bǔ)脾之功，增加白術(shù)用量，以補(bǔ)為主，補(bǔ)通兼施，“補(bǔ)脾升清”恢復(fù)脾的運(yùn)化功能，“行氣降濁”恢復(fù)胃腸的通降功能，同時(shí)劑型由丸劑改為湯劑，縮短起效時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中也可以看到改良枳術(shù)方中高劑量組對(duì)于便秘模型大鼠的24 h糞便數(shù)目、糞便含水量均有明顯改善，縮短了腸道傳輸時(shí)間。

在作用機(jī)制上，改良枳術(shù)方一方面能夠抑制AQP3、AQP9的表達(dá)，減少腸道水分的重吸收，增加腸腔內(nèi)水分，使大便含水量增加，緩解便秘，這與我們既往的研究基本一致；另一方面可以提高M(jìn)UC2的表達(dá)，增加結(jié)腸粘液分泌，縮短糞便通過時(shí)間從而達(dá)到改善便秘的效果，與已有的研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方或中藥提取物通過刺激結(jié)腸粘液，增加腸道黏液層厚度發(fā)揮通便作用一致[19-20]。但本研究將AQPs和MUC2一起討論，并賦予其中醫(yī)“津”“液”不同屬性，對(duì)于便秘發(fā)生和中藥復(fù)方作用機(jī)制的揭示有一定的價(jià)值，同時(shí)也是對(duì)中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論的現(xiàn)代詮釋。

另外在腸道推進(jìn)率和24 h糞便數(shù)目?jī)蓚€(gè)方面改良枳術(shù)方組與莫沙必利組相比未能顯示出明顯優(yōu)勢(shì)，可能與莫沙必利作為促動(dòng)力藥物，其促動(dòng)力的效果相對(duì)明顯，改良枳術(shù)方主要作用機(jī)制在于增加腸道水液，改良枳術(shù)方組糞便含水量方面優(yōu)勢(shì)明顯，也佐證了這一觀點(diǎn)。而AQP9在便秘模型組和改良枳術(shù)方中劑量組均未能呈現(xiàn)與AQP3相同的顯著變化，猜測(cè)原因可能與AQP9在結(jié)腸水液代謝中并非發(fā)揮核心作用相關(guān)。另外在蛋白表達(dá)比較中免疫組化與WB結(jié)果在具體結(jié)果上可能稍有不同，但總體趨勢(shì)未變，可能與檢測(cè)方法不同有關(guān)，后續(xù)可引入其他檢測(cè)方法或增大樣本量來驗(yàn)證。

綜上所述，AQP3/AQP9、MUC2介導(dǎo)的結(jié)腸“津”“液”代謝在便秘發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，改良枳術(shù)方用于便秘療效確切，其可能的作用機(jī)制為通過調(diào)控AQP3/AQP9、MUC2從而影響結(jié)腸的“津”“液”代謝，增加腸道腸道水分，增加粘液層厚度，從而發(fā)揮通便作用。

本研究仍有不足之處和拓展的空間，在便秘形成過程中“津”“液”存在怎樣的動(dòng)態(tài)變化，AQPs和MUC2之間是否存在互補(bǔ)協(xié)調(diào)關(guān)系，改良枳術(shù)方通過何種途徑調(diào)控AQP3/AQP9、MUC2表達(dá)仍需后續(xù)進(jìn)一步研究。