生慧湯對APP/PS1雄性AD小鼠海馬內APP代謝產物的晝夜變化影響＊

文 純，游秋云，王 平，丁 莉＊＊

（1.湖北中醫藥大學藥學院 武漢 430065；2.湖北中醫藥大學老年醫學研究所 武漢 430065）

據報道[1]，阿爾茲海默病(Alzheimer Disease,AD)在我國65歲以上老年人群中發病率為5%。而隨著中國社會人口結構邁入老齡化，老年人口基數的增大，預估2030年我國AD患者數量接近1500萬，其治療將會給社會帶來沉重負擔。目前研究認為[2]，可溶性β淀粉樣蛋白(Amyloid beta-Peptides,Aβ)的腦內水平變化與AD發病密切相關，而可溶性β淀粉樣蛋白主要是由淀粉樣前體蛋白(Amyloid beta-Protein Precursor，APP)的淀粉樣蛋白代謝途徑生成，早老蛋白基因1(Presenilin-1，PS1)是APP代謝過程中γ分泌酶的亞單位，PS1基因發生突變，會特異性地促進Aβ1-42的形成[3]。因此，研究APP代謝產物顯得尤為重要。課題組前期研究發現[4-6]，APP/PS1雙轉基因小鼠在5月齡時，白天活動時間增加、休息減少，喪失晝伏特性，白晝與黑夜的活動時間不具有晝夜差異性。這并不符合嚙齒類動物晝伏夜出的生活習性，由此推測其自主活動節律性開始發生明顯紊亂。同時也有研究表明[7]，隨著白晝與黑夜之間活動規律差異縮小，會影響認知行為以及突觸的可塑性。已有研究顯示[8]，隨著年齡增長，老年人群常發生的晝夜節律紊亂會增加AD的患病風險，這可能是由于中樞晝夜節律的紊亂會引起APP代謝紊亂，導致Aβ的異常沉積[9]，同時Aβ在腦內的代謝與晝夜節律以及學習記憶聯系緊密[10,11]。APP代謝受到α、β、γ三種酶共同調控[12-14]，代謝產物包括sAPPα、sAPPβ和Aβ。根據調控APP代謝的酶不同[15]，將APP水解分為兩類：一是淀粉樣蛋白代謝(β、γ酶調控)，由β、γ酶對APP進行酶切水解，生成Aβ；二是非淀粉樣蛋白代謝(α酶調控)，由α酶對APP進行酶切，水解后的主要產物是sAPPα。

生慧湯出自《辯證錄·健忘門》，常用于治療失眠、健忘，由熟地黃、山茱萸、遠志、生棗仁、柏子仁、人參、茯神、石菖蒲以及白芥子九味中藥材組成。生慧湯研究主要與睡眠及晝夜節律有關[16,17]，一是生慧湯可減輕睡眠剝奪對神經元的損傷，可能是與其調節PSD95和SYN表達及調控凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達有關；二是生慧湯能夠上調節律基因Bmal1的表達，降低IL-6、TNF-α的含量，從而調節晝夜節律紊亂改善AD。而生慧湯對AD癡呆模型APP代謝產物的晝夜變化影響少有報道。

因此，本文采用生慧湯干預APP/PS1雙轉基因小鼠，通過酶聯免疫吸附(ELISA)檢測不同時間段取出的海馬組織sAPPα表達水平，對海馬β淀粉樣蛋白1-40、β淀粉樣蛋白1-42表達進行免疫印跡分析，免疫組化(IHC)檢測海馬CA1區Aβ1-40蛋白的表達，以此研究生慧湯對AD模型小鼠海馬內APP代謝產物的晝夜變化影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

AD模型動物：5月齡SPF級雄性APP/PS1雙轉基因小鼠56只，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號SCXK(遼)2020-0001，對照組動物：5月齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠14只，許可證號SCXK(遼)2020-0002。飼養在湖北中醫藥大學老年醫學研究所動物房屏障環境，允許自由攝食與飲水。

1.2 生慧湯的制備

生慧湯：由熟地黃30 g，山茱萸12 g，遠志6 g，生棗仁15 g，柏子仁(去油)15 g，茯神9 g，人參9 g，石菖蒲1.5 g，白芥子6 g組成，購自湖北中醫藥大學藥房，批號:20201201。所有藥材按組方比例稱取，加入稱取藥材總重量的8倍量水浸泡1 h，加熱至沸騰開始計時，1 h后濾取藥液。藥渣加水重復以上操作，濾取藥液。合并藥液，濃縮至1.35 g/mL、2.70 g/mL，4℃保存。

1.3 試劑與儀器

一抗：GAPDH抗體；Aβ1-40抗體、Aβ1-42抗體(武漢賽培生物科技有限公司，貨號：SP11457，SP11731)；二抗：羊抗兔二抗，羊抗鼠二抗(Servicebio，貨號：GB21302,GB21303)；sAPPαELISA試劑盒(美國IBL公司，貨號：27734)，RIPA裂 解 液、SDS-PAGE凝 膠 制 備 試 劑 盒(Servicebio，貨號：G2002，G2003)。

RT-6100酶標儀(Rayto),D3024R臺式高速冷凍離心機(DRAGONLAB),TSY-B脫色搖床(Servicebio),BV-2垂直電泳儀(Servicebio),DMS-2型Morris水迷宮（中國醫學科學研究院藥物研究所）,ZH自發活動分析系統（淮北正華生物儀器設備有限公司）。

1.4 實驗分組及給藥

將56只雄性APP/PS1轉基因小鼠按隨機數字表法分為：模型組、褪黑素組、生慧湯低劑量組、生慧湯高劑量組4組，每組14只。對照組為5月齡C57BL/6J小鼠，14只。按體表面積折算等效劑量，分別計算給藥劑量，褪黑素組(0.78 mg·kg-1·d-1)、生慧湯高、低劑量組(27.0 g·kg-1·d-1、13.5 g·kg-1·d-1,等 效 劑 量 的2倍、1倍)，對照組與模型組灌胃相同體積的生理鹽水，給藥容量均為10 mL·kg-1，每日上午9:00灌胃，連續30天。

1.5 水迷宮實驗

第27天，進行水迷宮行為學實驗，預先向水池中加水至沒過平臺2 cm，用奶粉將水池顏色染成乳白色掩蓋平臺，避免小鼠因視覺而找到平臺。對小鼠進行訓練，90 s內小鼠未找到平臺，人工引導小鼠至平臺，停留15 s，訓練三天，第四天(第30天)進行定位航行試驗，將小鼠面向池壁放入水中，找到平臺停留3 s后，系統自動停止計時，找到平臺時間為上平臺潛伏期，90 s內未找到平臺記錄為90 s。第31天進行空間探索實驗，撤去平臺后，將小鼠面向池壁放入水中，記錄90 s內小鼠穿越原平臺次數。

1.6 動物取材

連續灌胃30天后，第31天行為學實驗結束后，小鼠脫頸椎處死，斷頭，置于鋪有一張濾紙的冰袋上，用眼科剪刀小心從正中矢狀位剪開0.5 cm，用鑷子剝去小鼠顱骨，分離腦組織，剝離海馬組織置于EP管，放入冰中，取材結束后放入-80℃冰箱保存備用。

1.7 ELISA法檢測不同時間段海馬中sAPPα表達水平

從-80℃冰箱中取出海馬組織，稱取少量，置于勻漿機勻漿，離心15 min(相對離心力為3304 g)，吸取上清液，按試劑盒說明書進行檢測。

1.8 Western Blot法檢測β淀粉樣蛋白1-40和β淀粉樣蛋白1-42

從-80℃冰箱中取出海馬組織，剪碎，加入裂解液，勻漿，之后置于勻漿管中，放置冰上裂解30 min，每5 min震蕩一次，12000 r/min,離心10 min，取上清液，按十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）制備試劑盒說明書制備凝膠，轉膜，按抗體說明書加入一抗、二抗，凝膠圖像分析系統進行分析，檢測小鼠海馬組織Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表達水平。

1.9 免疫組織化學法檢測小鼠海馬CA1區β淀粉樣蛋白1-40的表達

每組4只小鼠小心取出完整全腦，全腦表面若有血殘留，用生理鹽水沖去表面血，放入裝有固定液的標本瓶，石蠟包埋，切片，染色，拍照，觀察小鼠海馬CA1區Aβ1-40蛋白表達情況，并采用image j軟件分析計算平均光密度，進行比較。

1.10 統計學處理

2 結果與分析

2.1 水迷宮結果

結果如圖1、圖2所示，與對照組相比，模型組小鼠上平臺潛伏期延長，穿越平臺次數減少(P＜0.01、P＜0.01)；與模型組相比，生慧湯給藥組小鼠上平臺潛伏期縮短，穿越平臺次數增加(P＜0.01、P＜0.05)。

圖1 各組小鼠上平臺潛伏期(n=14)

圖2 各組小鼠穿越平臺次數(n=14)

2.2 生慧湯對各組小鼠海馬sAPPα表達水平的影響

2.2.1 sAPPα總量比較

結果如圖3所示，與對照組相比，模型組小鼠海馬組織sAPPα總量減少(P＜0.01);與模型組相比，生慧湯不同劑量組小鼠海馬組織中sAPPα總量增加(P＜0.01、P＜0.05)。

圖3 小鼠海馬組織sAPPα總量比較(pg/mL，n=10)

2.2.2 sAPPα含量晝夜差異比較

結果如圖4所示，通過比較兩個不同時間段（12:00與24:00）sAPPα含量，發現對照組小鼠海馬內sAPPα含量具有明顯晝夜差異(P＜0.01)，而模型組sAPPα含量的晝夜差異現象消失(P＞0.05)；生慧湯高劑量能夠恢復sAPPα含量的晝夜差異表達(P＜0.01)。

圖4 小鼠海馬中sAPPα晝夜差異比較(pg/mL,n=5)

2.2.3不同時間段的sAPPα含量比較

結果如圖5所示，12:00時，與對照組相比，模型組小鼠海馬內sAPPα含量明顯下降(P＜0.01)；與模型組相比，褪黑素組、生慧湯高劑量組sAPPα含量明顯增加(P＜0.01)，生 慧 湯 低 劑 量 組sAPPα含 量 無 差 異(P＞0.05)；24:00時，與對照組相比，模型組sAPPα含量明顯下降(P＜0.01)；與模型組相比，生慧湯高劑量組sAPPα含量無差異(P＞0.05)，生慧湯低劑量組sAPPα含量明顯增加(P＜0.05)。（見圖5）

2.3 生慧湯對海馬組織β淀粉樣蛋白表達水平的影響

結果如圖6所示，與對照組相比，模型組小鼠海馬組織Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表達水平明顯升高(P＜0.01)；與模型組相比，生慧湯高劑量組小鼠海馬組織Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表達水平明顯下降(P＜0.01)，生慧湯低劑量組小鼠海馬組織中僅Aβ1-40蛋白表達下降(P＜0.05)，對Aβ1-42蛋白的表達影響不顯著(P＞0.05)。

圖6 各組小鼠海馬Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表達

2.4 生慧湯對小鼠海馬CA1區Aβ1-40表達的影響

與對照組相比，模型組小鼠海馬CA1區中Aβ1-40表達明顯增加(P＜0.01)；與模型組相比，生慧湯不同劑量組Aβ1-40表達不同程度減少(P＜0.01、P＜0.05)。

3 討論

圖7 小鼠海馬CA1區Aβ1-40表達免疫組化染色圖片(400×)

圖8 各組海馬CA1區中Aβ1-40含量差異比較(n=4)

目前，有關AD的發病機制主要分為：Aβ學說、Tau磷酸化學說、基因突變學說、炎癥學說、膽堿能學說、氧化應激學說。其中，大腦內Aβ大量沉積所形成的老年斑塊是AD患者最為明顯的病理學特征，與此同時，研究較為關注的是Aβ與tau蛋白、炎癥、膽堿能以及氧化應激之間的聯系。本文從晝夜節律切入，旨在研究晝夜節律對Aβ前體蛋白APP的影響，以此探討晝夜節律改善AD的可能機制。

3.1 sAPPα對APP代謝的影響及sAPPα的晝夜節律性

APP主要是通過非淀粉樣蛋白代謝途徑水解[18,19]，在sAPPα含量達到某一特定值時，會對APP的淀粉樣代謝途徑進行負調控，可能正是這種負調控機制，能夠減少Aβ的生成，降低Aβ腦內水平，起到了保護神經元細胞作用[20,21]，發揮抗AD作用。另有研究證明[22]，隨著晝夜的交替，腦內的sAPPα水平也呈現晝夜節律性變化，含量從白天到夜間呈逐漸升高趨勢，覺醒狀態時降低而睡眠狀態時升高。而節律的紊亂可能會引起APP的代謝發生異常：APP非淀粉樣蛋白代謝途徑減弱，降低了sAPPα水平，并且sAPPα水平的晝夜節律性變化消失，而APP的淀粉樣蛋白代謝途徑則會相應增強，該代謝途徑會產生可溶性Aβ肽，也就是說促進了可溶性Aβ肽的生成[23,24]，而Aβ的增加和異常沉積會引起AD的發生和加重。

3.2 結果

Morris水迷宮結果表明，生慧湯不同劑量組上平臺潛伏期明顯縮短，穿越平臺次數明顯增加。生慧湯高劑量組的sAPPα含量在全天總量、各時間段含量均明顯增加，同時Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表達受到抑制。sAPPα的含量升高提示APP非淀粉樣代謝活動增強，結合Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表達受到抑制，提示癡呆癥狀減輕的原因，可能是隨著sAPPα含量的升高，減弱了APP淀粉樣代謝活動，減少了Aβ的生成。

與對照組sAPPα含量具有明顯晝夜差異不同的是：在模型組中，sAPPα含量不具有晝夜差異；而褪黑素組和生慧湯組能明顯增加白天(12：00)sAPPα的含量，sAPPα的含量具有明顯晝夜差異，提示生慧湯組改善學習記憶可能是通過調節sAPPα含量的晝夜節律紊亂來實現。

3.3 結論

結合以上實驗結果，生慧湯改善5月齡APP/PS1阿爾茨海默病模型小鼠的學習記憶障礙，其機制可能與恢復海馬內APP代謝產物sAPPα的晝夜節律性表達、從而減少Aβ的沉積有關。

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