白術內酯Ⅲ通過調節自噬水平清除過氧化物減輕小鼠潰瘍性結腸炎＊

任 燕，黃明進，蔣雯文，羅春麗，張曉涵

（1.貴州大學藥學院 貴陽 550025；2.貴州大學農學院貴陽 550025）

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種累及直腸和結腸粘膜及粘膜下層的慢性炎癥性疾病，嚴重影響患者的日常生活[1]。臨床上用于癥狀控制的藥物，如糖皮質激素、5-氨基水楊酸類藥物和免疫調節劑仍不能達到令人滿意的療效，亟需開發更有效的潛在治療藥物[2]。研究報道UC的發病是由多因素引起的，具有典型的腸上皮屏障功能缺陷，自噬是一種細胞內降解途徑，有助于神經退行性疾病、癌癥、衰老和免疫中的細胞存活[3]。自噬發生在正常結腸的粘膜中，與UC的發病機制有關，且已證明在存在炎癥的情況下可以抑制細胞凋亡[4]。研究發現與未受損的粘膜相比，炎癥性腸病患者受損的粘膜中自噬通常受到損害[5]。鑒于自噬異?？赡軈⑴c炎性腸病的發病過程及在腸上皮細胞的損傷修復和維持腸道內環境的穩態上發揮重要作用，干預自噬過程可能作為潛在的治療UC藥物。白術內酯Ⅲ（AtractylenolideⅢ）是從中藥白術中提取的，白術具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效[6]。現代醫學研究顯示白術具有抗炎、抗腫瘤、調節免疫等作用，包括對不明原因引起的腸炎有顯著療效[7]。然而白術有效成分白術內酯Ⅲ對潰瘍性結腸炎療效及作用機制尚不清晰。因此，本研究擬從細胞自噬清除過氧化物角度探究白術內酯Ⅲ對UC的保護作用機制。

1 材料

1.1 動物

實驗選取雄性SPF級BALB/c小鼠32只，6-8周，體質量18-20 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，使用許可證號為SYXK（川）2019-189，生產許可證號為SCXK（川）2020-030。所有小鼠飼養于相對濕度45-55%，溫度（24±2）℃、12∶12 h的暗/光周期的環境中，小鼠可以自由飲水和飲食。

1.2 主要試劑及儀器

白術內酯Ⅲ（CAS：73069-13-3，規格20 mg/支）購自成都德思特生物；2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，貨號：P2297）購自美國Sigma公司；自噬抑制劑3-MA（貨號：CD-07263-ML）購自武漢純度生物；超氧化物歧化酶（SOD，貨號：ZC-38036）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX，貨號：ZC-38196）、丙二醛（MDA，貨號：ZC-38015）ELISA試劑盒購自上海茁彩生物；相關一抗Beclin-1（貨號：ab210498）、LC3Ⅰ（貨號：ab192890）、LC3Ⅱ（貨號：ab48394）、p62（貨號：ab109012）及生物素化山羊抗兔IgG（H+L）（貨號：ab6721）購自英國Abcam；Western細胞裂解液（批號：89901）、BCA蛋白定量試劑盒（貨號：23227）、ECL發光試劑盒（貨號：WP20005）購自上海Thermo Scientific；全功能酶標儀MK3（美國Thermo Fisher儀器）。

2 方法

2.1 潰瘍性結腸炎小鼠模型制備

采用TNBS/乙醇法建潰瘍性結腸炎小鼠模型[8]。小鼠適應性飼養1周后，隨機選取8只作為空白組，剩余24只作為造模組。造模小鼠使用7 g·L-1的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，擺放成頭低腳高位（30°），自肛門注入0.1 mL TNBS 500 mL·L-1的乙醇溶液（單只小鼠TNBS劑量為150 mg·kg-1），保持體位30 min?？瞻捉M小鼠麻醉后，結腸僅注入乙醇溶液（0.1 mL）。7天后，小鼠精神萎靡、活動量下降、排便次數增加且出現稀便甚至血便等現象，提示造模成功。造模成功后小鼠隨機分為模型組、白術內酯Ⅲ組、白術內酯Ⅲ+自噬抑制劑組。

2.2 給藥方法

小鼠造模成功后第2天開始給藥治療?？瞻捉M和模型組按體質量每10 g灌胃無菌生理鹽水0.1 mL；白術內酯Ⅲ組按20 mg·kg-1劑量每日灌胃1次；白術內酯Ⅲ+自噬抑制劑組在灌胃期間，腹腔注射自噬抑制劑3-MA（2 mg·kg-1），連續治療14天。

2.3 小鼠疾病活動指數（DAI）

小鼠DAI評分標準由體質量下降分數、大便性狀分數、便血分數3部分組成，計算公式：DAI=（體質量下降分數+大便性狀分數+便血分數）/3[9]。

2.4 結腸黏膜損傷指數（CMDI）評分

治療結束后將截取的結腸段用預冷的生理鹽水沖凈，肉眼觀察并評分。CMDI評分標準：無損傷為0分；水腫、輕度充血為1分；水腫、充血、糜爛或腸粘連為2分；水腫、高度充血、壞死及潰瘍（縱徑＜1 cm）形成為3分；水腫、高度充血、黏膜壞死及潰瘍（縱徑＞1 cm）形成或全腸壁壞死為4分。

2.5 小鼠結腸長度、重量測量

治療結束后，截取小鼠結腸段，采用游標卡尺準確測量小鼠結腸自然長度并稱量體質量。

2.6 HE染色觀察結腸組織病理變化

將小鼠結腸組織經4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋后，組織切片5μm的厚度，蘇木精-伊紅（HE）染色，進行結腸組織的病理變化分析。

2.7 ELISA檢測結腸組織SOD、GSH-PX、MDA含量

取小鼠結腸組織，將結腸組織在冰磷酸緩沖液（PBS）中沖洗，濾紙吸干后，加入PBS（5 mL）于冰上勻漿，反復凍融2次，以5000 rpm離心20 min，根據ELISA試劑盒測定結腸組織SOD、GSH-PX、MDA含量。

2.8 Western Blot檢測結腸組織Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表達

使用RIPA裂解緩沖液從冰上的結腸組織中分離總蛋白，采用BCA試劑盒測定每組中的蛋白質濃度。含有50μg蛋白質的樣品在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，然后轉移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉后，將膜與1∶500稀釋的一抗（Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62）或1∶2500稀釋的βactin一起在4℃孵育過夜。然后與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的抗兔IgG的1∶3000稀釋液一起室溫孵育后，ECL試劑盒顯色，通過Image-ProPlus軟件對條帶的強度進行量化，以β-actin為內參。

2.9 透射電鏡觀察結腸上皮細胞中的自噬泡

為了通過透射電鏡分析自噬，將結腸組織在4℃的2.5%戊二醛中固定，在1%的鋨酸中固定2 h，通過梯度乙醇脫水，然后逐漸嵌入環氧樹脂，切片（50 nm）在1%甲苯胺藍染色，后醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，用透射電子顯微鏡獲得顯微照片。

2.10 統計學方法

使用SPSS 22.0軟件（IBM Corp.）對數據進行統計分析，數據表示為平均值±標準差（±s），兩組間均數比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），p＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 白術內酯Ⅲ對潰瘍性結腸炎小鼠DAI、CMDI的影響

與空白組比較，模型組小鼠DAI、CMDI評分明顯升高（P＜0.01），與模型組比較，白術內酯Ⅲ組和白術內酯Ⅲ+3-MA組DAI、CMDI評分均明顯降低（P＜0.01），與白術內酯Ⅲ組比較，白術內酯Ⅲ+3-MA組DAI、CMDI評分明顯升高（P＜0.05），見表1。

表1 白術內酯Ⅲ對潰瘍性結腸炎小鼠DAI、CMDI的影響

3.2 白術內酯Ⅲ對潰瘍性結腸炎小鼠結腸長度和重量的影響

與空白組比較，模型組小鼠結腸長度明顯縮短且單位結腸重量明顯升高（P＜0.01），與模型組比較，白術內酯Ⅲ組和白術內酯Ⅲ+3-MA組小鼠結腸長度明顯升高，單位結腸重量明顯降低（P＜0.05），與白術內酯Ⅲ組比較，白術內酯Ⅲ+3-MA組小鼠結腸長度明顯降低，單位結腸重量明顯升高（P＜0.05），見表2。

表2 白術內酯Ⅲ對潰瘍性結腸炎小鼠結腸長度和重量的影響

3.3 白術內酯Ⅲ對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理變化的影響

空白組：結腸組織黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層結構較完整，未見明顯病理變化。模型組：結腸組織大面積潰瘍灶，累及黏膜下層、肌層和漿膜層，見黏膜層和黏膜下層分界不清，腸腺結構完全消失，潰瘍灶內見滲出纖維素、粘液、壞死組織和大量炎細胞，以核深染圓形的淋巴細胞和分葉核的中性粒細胞為主，大量纖維組織增生，見較多核呈長橢圓形深染的成纖維細胞。白術內酯Ⅲ組：結腸組織黏膜表面被覆單層柱狀上皮，黏膜固有層內大腸腺排列較為密集，局部黏膜下層少量纖維組織增生，肌纖維之間少量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主。白術內酯Ⅲ+3-MA組：黏膜表面被覆單層柱狀上皮，黏膜固有層內大腸腺排列較為密集，局部黏膜下層細胞變性壞死，見壞死區域腸腺萎縮、壞死，有少量的炎性細胞浸潤及較多的纖維組織增生，見圖1。

圖1 白術內酯Ⅲ對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理變化的影響（HE）

3.4 白術內酯Ⅲ對潰瘍性結腸炎小鼠SOD、GSH-PX、MDA含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠SOD、GSH-PX含量明顯降低，MDA含量明顯升高（P＜0.01），與模型組比較，白術內酯Ⅲ組SOD、GSH-PX含量明顯升高，MDA含量明顯降低（P＜0.05），與白術內酯Ⅲ組比較，白術內酯Ⅲ+3-MA組SOD、GSH-PX含量明顯降低（P＜0.05），MDA含量無差異統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 白術內酯Ⅲ對潰瘍性結腸炎小鼠SOD、GSH-PX、MDA含量的影響

3.5 白術內酯Ⅲ對潰瘍性結腸炎小鼠細胞自噬水平的影響

與空白組比較，Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達在模型組中明顯降低，p62蛋白表達在模型組中明顯升高（P＜0.05），與模型組比較，白術內酯Ⅲ組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達明顯升高，p62蛋白表達明顯降低（P＜0.05），與白術內酯Ⅲ組比較，白術內酯Ⅲ+3-MA組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達明顯降低（P＜0.05），p62蛋白表達無差異統計學意義（P＞0.05）（圖2A）。透射電鏡觀察結果顯示，空白組小鼠線粒體無自噬現象。模型組小鼠線粒體腫脹及邊緣不規則脊紊亂或消失，見少量自噬小體吞噬受損線粒體以及與溶酶體融合的受損線粒體。白術內酯Ⅲ組小鼠線粒體腫脹變形、見受損線粒體被自噬小體吞噬，以及溶酶體與受損線粒體融合。白術內酯Ⅲ+3-MA組小鼠線粒體組小鼠脊紊亂、消失同時可見一些自噬小體吞噬受損（圖2B）。

圖2 白術內酯Ⅲ對潰瘍性結腸炎小鼠細胞自噬水平的影響

4 討論

針對UC的治療目前尚無統一有效的藥物，治療方法仍在不斷探索及更新中。已有證據表明中醫藥在治療UC方面具有獨特優勢，并且具有治療方式靈活多樣、毒副作用較小等優點，且中醫藥界對于UC的治療也在積極尋找療效確切的藥物[8,10]。白術內酯Ⅲ為中藥白術成分，白術藥用歷史悠久，在《神農本草經》中已有記載，列為上品[11]，《醫學啟源》記載白術“除濕益燥、和中益氣、溫中、去脾胃中濕。除胃熱、強脾胃、進飲食、和胃、生津液、主肌熱、四肢困倦、目不欲開、怠惰嗜臥、不思飲食、止渴、安胎”[12]，白術活性成分豐富，有較突出的藥理作用。前期研究證實白術內酯III可減少體外和體內哮喘模型中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體的激活和Th1/Th2失衡[13]。白術內酯III可通過激活Nrf2/NQO1/HO-1通路減輕博萊霉素誘導的實驗性肺纖維化和氧化應激[14]。此外，白術內酯III可通過抑制成纖維細胞生長因子受體-1、-2和-4的表達來增強多西紫杉醇對胃癌細胞的抗腫瘤作用[15]。由此看出，白術內酯III是通過多個靶點起作用，但由于更進一步機制研究尚缺乏，故本研究采用小鼠UC模型探討白術內酯Ⅲ的療效并初步探討其作用機制，為白術內酯Ⅲ臨床應用于UC防治提供理論基礎。首先從小鼠疾病活動指數、結腸黏膜損傷指數評分及結腸長度和重量角度觀察發現UC模型小鼠疾病活動指數、結腸黏膜損傷指數評分明顯升高，結腸長度明顯縮短且單位結腸重量明顯升高，而白術內酯Ⅲ明顯降低了小鼠疾病活動指數、結腸黏膜損傷指數評分并增加了小鼠結腸長度，相反，白術內酯Ⅲ自噬抑制劑3-MA明顯升高小鼠疾病活動指數、結腸黏膜損傷指數評分，降低小鼠結腸長度。其次從病理角度觀察發現UC模型小鼠結腸組織大面積潰瘍灶，潰瘍灶內見滲出纖維素、粘液、壞死組織和大量炎細胞。白術內酯Ⅲ治療后小鼠結腸組織黏膜表面被覆單層柱狀上皮，黏膜固有層內大腸腺排列較為密集，肌纖維之間少量炎性細胞浸潤。提示白術內酯Ⅲ對UC具有治療效果，且可能通過自噬水平發揮治療作用。

目前，UC的病理機制尚不明確，然而研究顯示炎性細胞因子過度產生和氧化應激是UC發展過程中結腸損傷的一個重要標志，促炎細胞因子會招募和激活免疫細胞，包括調節性T細胞和輔助T細胞，且在腸道中，活性氧作為一種信號分子可以刺激炎癥信號，在UC中起著核心作用[16]。促炎細胞因子和活性氧的過度產生會放大免疫信號，加劇腸道上皮的破壞[17]。此外，研究證據表明自噬和炎癥之間存在關聯，自噬通過幾種機制調節炎癥反應，包括選擇性降解促炎復合物或炎癥體刺激[18]。在腸道中，已報道自噬介導先天免疫和獲得性免疫中的關鍵功能[3]。且自噬是在炎癥過程中通過損傷相關的分子模式和幾種致炎細胞因子誘導的，其主要目的是控制感染，作為宿主對微生物入侵反應的一部分[19]。然而，高水平的這些細胞因子或活性氧在損傷后產生，可以破壞控制自噬所需的信號[20]。研究顯示Beclin-1和自噬活化呈正相關，p62是負相關，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可表示自噬的活化程度[21]。本研究結果顯示UC模型小鼠結腸組織SOD、GSH-PX含量明顯降低，MDA含量明顯升高，白術內酯Ⅲ治療可抑制小鼠MDA含量的升高，促進SOD、GSH-PX的生成，而白術內酯Ⅲ+自噬抑制劑3-MA干預后SOD、GSH-PX含量明顯降低。進一步檢測自噬水平結果顯示UC模型小鼠自噬受損，Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達明顯降低，p62蛋白表達明顯升高，白術內酯Ⅲ治療后Beclin-1蛋白表達明顯升高，p62蛋白表達明顯降低，白術內酯Ⅲ+自噬抑制劑3-MA干預后Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達明顯降低，且透射電鏡觀察顯示白術內酯Ⅲ+3-MA組小鼠脊紊亂、消失，同時可見一些自噬小體吞噬受損，而白術內酯Ⅲ組小鼠線粒體被自噬小體吞噬。表明自噬抑制劑3-MA阻止了白術內酯Ⅲ誘導的p62蛋白表達減少，且自噬抑制劑3-MA干預后小鼠結腸組織SOD、GSH-PX含量明顯降低，提示白術內酯Ⅲ可能通過促進自噬清除過氧化物，防止TNBS引起的UC炎癥。

5 結論

綜上所述，白術內酯Ⅲ可有效地調節細胞自噬進而清除過氧化物質，防治潰瘍性結腸炎腸黏膜損傷，具有臨床應用的可能性，其更進一步的作用機制尚有 待進一步研究。