電針調控AQP4、ZO-1的表達對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響＊

鄧小嫚，康琳玲，鐘京琛，倪思銘，雷丹丹，彭擁軍

（南京中醫藥大學附屬醫院 南京 210029）

腦卒中是我國目前發病率、致殘率、致死率、復發率均較高的疾病之一，也是我國目前傷殘調整壽命年的主要原因[1]。缺血性腦卒中的發病率占據腦卒中發病率第一位，約為87%[2]。腦卒中的發生目前認為是由于各種原因導致的腦組織缺血、缺氧進而發生壞死或軟化，表現為腦組織損害及腦功能障礙。腦卒中患者常易罹患各種并發癥，如癲癇、腦水腫、腦出血、卒中后抑郁、卒中后焦慮、卒中后便秘、卒中后尿潴留、肺部感染、尿路感染等，不僅危害患者身心健康，還增加經濟負擔[3]。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）被定義為由于缺血、缺氧但尚未發生器質性壞死、仍具有可逆性的腦組織在恢復血液供應后產生的病情惡化[4]。CIRI引起的梗死可能是不可逆性的，這種損傷比永久性血管閉塞危害更甚，因此，為了提高腦卒中患者的生存率、降低致殘率、改善神經功能及生活質量，探討腦缺血有效療法及其作用機制十分關鍵。

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是介于血液和腦組織之間對某些物質的通過具有選擇性阻礙功能的動態界面，主要是由毛細血管內皮細胞、細胞間的緊密連接、周細胞以及星形膠質細胞末端足部構成[5]。BBB的結構和功能遭到破壞，是引起血管源性腦水腫，造成卒中患者腦組織損傷的重要原因之一。紋狀體是大腦基底神經節主要組成部分，前期研究采用IgG免疫組化法測定腦組織中的IgG來反映BBB的通透性，發現紋狀體是腦缺血再灌注期間BBB首先遭受破壞的區域[6]。水通道蛋白-4（Aquaporin-4，AQP4）是位于BBB兩側的一種雙向水轉運蛋白，被認為是調節腦組織水分子代謝最重要的水通道蛋白[7]，參與了腦水腫的發生發展。采用siRNA質粒可有效沉默AQP4在受損腦組織的表達，明顯減輕腦水腫[8]。毛細血管內皮細胞是由緊密連接蛋白連接，而閉鎖小帶蛋白-1（zonula Occludens，ZO-1）是參與緊密連接即血腦屏障的構成的重要結構之一，對穩定內皮細胞連接起著重要的樞紐作用。研究表明，ZO-1蛋白水平的變化與BBB的損傷程度具有高度相關性。腦缺血再灌注損傷發生后，相關蛋白表達的變化致使BBB的超微結構及通透性發生改變，從而引起腦水腫，導致神經細胞的損傷及凋亡。

祖國醫學常采用針灸“水溝穴”和“百會穴”治療缺血性中風，有著顯著療效及獨特優勢[9]。電針療法是在針灸的基礎上進行低頻脈沖電刺激，近年來，電針被報道[10]可以通過改善腦卒中患者血腦屏障的通透性、改善微循環、治療缺血性中風，但其作用機制仍尚不明確，可能與AQP4、ZO-1的表達存在聯系。因此，本研究制作了大鼠腦缺血再灌注損傷模型，探討電針后BBB通透性與AQP4、ZO-1表達的關系，以期為電針治療腦缺血再灌注損傷引起的血腦屏障損傷及腦水腫提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康的雄性SD大鼠（6-8周齡，210-230 g）由南京中醫藥大學SPF級實驗動物中心提供。根據隨機數字表法，本實驗將SD大鼠隨機分為5組：正常對照組（NC）、MCAO模型組（M）、電針組（EA）、AQP4 siRNA組（siRNA）和空載質粒組（EP）。根據再灌注6 h、12 h、24 h、48 h和72 h這5個時間點將大鼠分別處死，并分為5個亞組。所有大鼠均置于于室溫（22-25℃）中飼養，自由飲食。每種實驗方法每個時間點選取大鼠6只。

1.2 實驗方法

1.2.1 MCAO模型建立

根據改良后的Longa線栓塞法[11]，制作急性腦缺血再灌注(MCAO)模型。采用10%水合氯醛（0.36 mL/100 g）腹腔注射將大鼠進行麻醉，用高速顱骨鉆于大鼠后囟鉆取一合適小孔，將激光多普勒血流儀（LDF）插入小孔內，探頭插至大鼠皮層表面，監測腦血流5 min，記錄的腦血流為缺血前的基礎值。隨后將大鼠以仰臥位固定在操作臺上，在其頸正中做一長度合適的切口，剝離血管及其周圍神經，將分離出來的右翼腭突動脈用微動脈夾仔細夾閉，然后再分別夾閉大鼠的右頸外動脈、頸總動脈、頸內動脈。于右頸外動脈處用顯微外科剪剪一小口，將直徑0.18 mm 4-0號尼龍外科手術縫合線由此切口插入右頸內動脈，撤去微動脈夾，插至顱內，插入的深度約18-20 mm，此時有明顯的阻力感，即到達大腦中動脈入口，撤去頸總動脈和翼腭突動脈上動脈夾。此時，LDF監測的腦血流量驟然下降至造模前15%以下[11]，大鼠腦缺血模型即構建成功，1 h后，將尼龍線撤至頸外動脈處時，為腦缺血再灌注的開始。

1.2.2電針干預

EA組于腦缺血5 min時進行針刺，使用0.25×15 mm的華佗牌毫針，刺入大鼠的“水溝穴”（GV26）和“百會穴”（GV20），然后接G6805-Ⅱ型電針治療儀（上海醫用電子機械有限公司，上海）。參數設置為：疏密波：密波頻率為6.25 Hz，持續2.08 s；疏波頻率為3.85 Hz，持續1.28 s，電流強度為0.8-1.3 mA，時間30 min。

1.2.3右側腦室給藥

將siRNA組與EP組大鼠備皮后以仰臥位固定于操作臺上，在腦立體定向儀的指導下，于矢狀線旁約1 mm及冠狀線后約1.5 mm處穿刺右側腦室[12]，進針的深度定為1.5 mm。腦缺血后5 min，采用高速顱骨鉆于大鼠右側腦室注射部位正上方鉆穿顱骨，然后插入微量注射器，分別向siRNA組和EP組大鼠右側腦室緩慢注入已經配置好的AQP4 siRNA表達質粒和不含AQP4 siRNA的空載質粒，注射量為10μg（10μL）。操作結束后，于注射部位擦少許骨蠟，并且縫合外皮，即完成給藥。

1.3 檢測方法

1.3.1大鼠神經功能缺損評分評定

參考改良的Zea Longa 8級神經功能缺損評分法對大鼠進行神經功能評分[12]。見表1。

表1 神經功能缺損評分

1.3.2 CV染色法

本實驗將各組大鼠斷頭取腦后，提取其腦組織，每只大鼠每隔12張取1張腦片，共取18張。采用CV染色法進行染色，主要通過脫水、復水、染色、分色及脫水、透明、封片等6個具體步驟完成。然后采用梯形公式，利用圖像分析和處理系統（Q5701W，Leica，German）及其軟件來測定每一張腦片缺血側及其對側的面積。公式如下所示：

V=1/2（S1+S2+S2+...Sn-1+Sn-1+Sn）×30×間隔張數

缺血側腦半球的腫脹百分比=（V缺血側-V對側）/V對側×100%

1.3.3 Western blot

采用Western blot方法檢測各組大鼠右腦紋狀體中AQP4和ZO-1蛋白含量的表達情況[13]。分別于大鼠腦缺血再灌注6 h、12 h、24 h、48 h和72 h這5個時間點處死大鼠，并提取大鼠腦組織，參照上述文獻的方法進行實驗。

1.3.4 RT-PCR

大鼠新鮮腦組織取材后，分離出右側紋狀體，按照TRIzol法提取大鼠總RNA，根據Promega公司提供的逆轉錄試劑盒說明書成功逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR。用2.5%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，灰度值用Syngene SYDR-1990系統（Amersham）測定，用目的條帶與β-actin的灰度值的比值作為靶基因的表達，A部分及B部分引物序列如下圖所示。見表2。

表2 引物序列

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，若計量資料符合正態分布，用均數±標準差（±s）進行描述，若不符合則進行秩和檢驗。多組間比較采用單因素方差分析或秩和檢驗，若兩組間比較方差齊時采用LSD法，若方差不齊則采用Dunnett T3方法；并且采用Person相關分析。若P＜0.05，則認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針改善神經功能

與NC組相比，M組與EP組大鼠神經功能缺損程度較重（P＜0.05），與M組及EP組相比，EA組及siRNA組大鼠神經功能缺損程度較輕（P＜0.05），而M組與EP組神經功能缺損評分表達無明顯統計學差異（P＞0.05），EA組及siRNA組神經功能缺損評分表達無明顯統計學差異（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠不同時程神經功能缺損評分比較（±s,n=30）

表3 各組大鼠不同時程神經功能缺損評分比較（±s,n=30）

注：與M組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.2 電針改善大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫和腦梗死

各組大鼠采用CV染色后，可發現M組與EP組大鼠于腦缺血再灌注6 h時發生腫脹，且逐漸加重。與M組相比較，EA組及siRNA組大鼠腫脹率于再灌注24 h、48 h、72 h具有顯著性差異（P＜0.05）。見表4。且M組大鼠CV染色后，可見大鼠腦組織出現明顯的白色梗死灶（圖1），CV染色法用于測量腦梗死灶較傳統的TTC染色分布更直觀，測量數據更精準。

圖1 M組大鼠缺血再灌注24 h CV染色

表4 各組大鼠腦水腫引起的腦半球腫脹率比較（%,±s,n=30）

表4 各組大鼠腦水腫引起的腦半球腫脹率比較（%,±s,n=30）

注：與M組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.3 電針有效下調AQP4蛋白和上調ZO-1蛋白的表達

與NC組 相 比，M組、EP組、EA組 及siRNA組AQP4蛋白均于12 h開始明顯表達，逐漸上升，且M組和EP組AQP4蛋白的表達明顯高于EA組及siRNA組（P＜0.05），其中M組和EP組AQP4蛋白的表達無統計學意義（P＞0.05），EA組及siRNA組AQP4蛋白的表達無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠不同時程AQP4蛋白的表達情況

隨著腦缺血再灌注的進展，M組、EP組、EA組及siRNA組ZO-1蛋白的表達均顯著下降，且M組、EP組ZO-1蛋 白 的 表 達 顯 著 低 于EA組 和siRNA組（P＜0.05）。其中M組和EP組ZO-1蛋白的表達無明顯統計學差異（P＞0.05），EA組及siRNA組ZO-1蛋白的表達無明顯統計學差異（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠不同時程ZO-1蛋白的表達情況

2.4 電針有效下調AQP4 mRNA和上調ZO-1 mRNA的表達

M組、EP組、EA組及siRNA組大鼠AQP4 mRNA均于12 h開始顯著表達，逐漸上升，且M組和EP組AQP4mRNA的表達明顯高于EA組及siRNA組（P＜0.05），其中M組和EP組AQP4mRNA的表達差異無統計學意義（P＞0.05），EA組及siRNA組AQP4mRNA的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠不同時程AQP4 mRNA相對含量的變化

隨著腦缺血再灌注的進展，M組、EP組、EA組及siRNA組ZO-1mRNA的表達均顯著下降，且M組、EP組ZO-1mRNA的表達顯著低于EA組和siRNA組（P＜0.05）。其中M組和EP組ZO-1mRNA的表達差異無統計學意義（P＞0.05），EA組及siRNA組ZO-1mRNA的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠不同時程ZO-1 mRNA相對含量的變化

2.5 大鼠神經功能缺損評分與腦水腫腫脹率、AQP4及ZO-1表達的相關分析

采用Pearson相關分析比較在缺血再灌注24 h時M組、EP組、EA組及siRNA組各組大鼠神經神經功能缺損評分與腦水腫腫脹率、AQP4及ZO-1表達的相關性，結果表明，大鼠神經神經功能缺損評分與腦水腫腫脹率呈現正相關（r=0.673，P＜0.05），與AQP4的表達呈現正相關（r=0.618，P＜0.05），與ZO-1的表達呈現負相關（r=-0.635，P＜0.05）；AQP4與ZO-1的表達呈現負相關（r=-0.716，P＜0.01）。

3 討論

血腦屏障是人體外周循環與中樞神經系統（central nervous system，CNS）之間重要的物理及生化屏障，主要維持CNS內環境的相對穩定性[14-15]。BBB是主要由內皮細胞和緊密連接構成的具有選擇性阻礙作用的保護性屏障，可以有效阻止有害物質進入腦組織。腦缺血再灌注過程中血腦屏障的結構和功能遭到破壞，導致細胞旁通透性發生改變，引發腦水腫，其發生的分子水平機制尚不清楚，但可能與氧化應激、酸中毒、鈣離子超載、免疫功能損傷、線粒體功能障礙、細胞毒性以及炎癥反應等密切相關[16-17]。AQP4是位于BBB兩側介導水分子運動的水通道蛋白[7,18]，可通過影響BBB的完整性促進腦水腫的產生與消退[19]。BBB的完整性還與內皮細胞緊密連接的磷酸化水平有關，緊密連接是以Claudin蛋白為主由多種緊密連接蛋白構成的具有選擇性滲透的結構[20]，而ZO-1是緊密連接復合體中的一種十分重要的跨膜蛋白，通過肌動蛋白細絲，穩定內皮細胞連接，起著重要的樞紐作用。研究表明，ZO-1蛋白含量的變化與BBB損傷密切相關[21]。研究發現，大鼠腦缺血再灌注12 h時，在缺血側紋狀體最先染色。紋狀體區的BBB較易受到破壞，故我們采用大鼠右腦紋狀體來研究急性腦缺血再灌注后AQP4、ZO-1的表達情況。Taniguchi等[22]研究發現，AQP4 mRNA含量在MCAO第1天有微弱的上調，第3天達到高峰，持續7天左右減少，與水腫形成及消退的變化呈平行關系。前期通過實驗證實，大鼠腦缺血后腦水腫規律與臨床上腦水腫規律基本一致，缺血再灌注6 h開始發生腦水腫，于再灌注72 h最嚴重，與臨床上腦缺血急性期的癥狀表現相吻合，故本實驗選擇再灌注6 h、12 h、24 h、48 h和72 h這5個時間點進行進一步的觀察研究[6]。

針灸治療腦卒中的療效顯著，“水溝穴”和“百會穴”均是奇經八脈的督脈上的穴位，督脈入屬于腦，總督一身之陽氣，為陽脈之海。因此，針刺“水溝穴”及“百會穴”具有補腦益髓，醒神開竅之功效。電針療法是傳統針灸療法與低頻脈沖電刺激相結合的一種新型療法，可以標準化和客觀測量。當需要強刺激時，如治療腦卒中引起的癱瘓時，電針可能比傳統針灸療效更佳。研究顯示，電針不僅可以改善血液流變學和腦循環[9]，還可以降低血腦屏障通透性和腦水腫[23]，還能促進腦血管生成和神經生成[24]。Zhang等[25]發現電針“百會穴”（GV20）和人中穴（GV26）可以提高腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性，且與針刺時間有關。田健材等[26]通過實驗發現電針“水溝穴”可通過降低AQP4的表達減輕腦水腫，保護缺血性腦卒中大鼠腦組織的神經血管單元。前期的研究證明，腦缺血再灌注損傷與AQP4的表達上升關系密切，電針可有效地抑制AQP4蛋白和mRNA的表達，從而改善血腦屏障損傷，保護腦組織[27-28]。還通過實驗證實電針人中、“百會穴”可通過有效抑制ZO-1蛋白的減少改善血腦屏障損傷，緩解腦水腫[29]。Jung等[30]也發現電針預處理缺血性腦卒中小鼠可顯著減少AQP4的表達，增加緊密連接蛋白ZO-1和claudin-5的表達，從而降低腦梗死幾率，促進神經功能恢復。

本實驗通過制作腦缺血再灌注模型，發現除NC組外，其余四組大鼠均于腦缺血再灌注6 h時發生腫脹，且逐漸加重，AQP4均于缺血再灌注12 h開始顯著表達，并逐漸上升，ZO-1均于缺血再灌注12 h開始顯著下降。電針可上調AQP4的表達，下調ZO-1的表達，且隨著時間的進展，AQP4的表達逐漸上升，ZO-1的表達逐漸下降，與siRNA抑制劑作用相似。通過相關分析還發現，神經神經功能缺損評分與AQP4的表達呈正相關，與ZO-1的表達呈負相關，與以往研究相比，我們認為腦缺血再灌注損傷過程中AQP4與ZO-1的表達呈負相關，電針通過有效抑制AQP4的上升及ZO-1的下降，改善血腦屏障損傷，減緩腦水腫，保護腦組織。我們推測，采用AQP4的抑制劑或ZO-1興奮劑或通過信號轉導機制對腦卒中患者進行早期干預治療，則可能通過減少BBB中水分子轉運，從而達到緩解腦水腫的目的，采用電針療法可能成為治療腦缺血再灌注損傷的一條新思路。本研究的創新性在于采用了改良的大鼠腦缺血再灌注模型制作方法，缺血效果確切可靠，穩定性好，手術時間短，遠優于傳統的方法。而且，我們采用了CV染色法用于顯示MCAO造模后腦梗死灶的分布及腦水腫情況，較以往的TTC染色法分布更直觀，不但節省了實驗動物的數量，保護了實驗動物的福利，而且降低了實驗過程中的測試誤差，提高了實驗數據的準確性。但是本研究仍存在局限性，由于組數有限，側腦室注射損傷未被排除。

綜上所述，我們推測，大鼠神經神經功能缺損評分與腦水腫腫脹率呈正相關，與AQP4的表達呈正相關，與ZO-1的表達呈負相關，腦缺血再灌注損傷過程中AQP4與ZO-1的表達呈負相關。調控AQP4、ZO-1的表達可能是電針“水溝穴”、“百會穴”治療腦缺血再灌注引起腦水腫及血腦屏障損傷的關鍵機制，有效地抑制AQP4的上升和ZO-1的下降可能成為腦卒中治療的新靶點。電針治療腦缺血再灌注損傷療效已被證實，未來可進一步探討電針對內皮細胞-星形細胞-周細胞共培養系統的作用機制[31]，還應該關注電針刺激頻率和刺激強度對AQP4、ZO-1蛋白和mRNA表達能力的影響，為電針治療腦缺血再灌注損傷尋找最合適的針刺時機和刺激量。