“合募配穴”針刺對肥胖胰島素抵抗大鼠骨骼肌組織SIRT1及PGC-1α表達的影響＊

張曉林，陳邵濤，劉輝輝，韓怡然，馬德慧，曹 迪，劉明軍＊＊

（1.湖北中醫藥大學針灸骨傷學院 武漢 430065；2.長春中醫藥大學針灸推拿學院 長春 130117；3.長春市中醫院 長春 130000）

胰島素抵抗（Insulin resistance,IR）是指多種因素導致機體胰島素分泌減少或者敏感性降低，從而影響葡萄糖攝取和利用的效率，并且代償性的分泌過多胰島素產生高胰島素血癥，以維持血糖的穩定[1-2]，主要表現為降低骨骼肌、肝臟和脂肪等器官和組織對正常濃度的胰島素生物學效應[3]。許多研究表明，胰島素抵抗是肥胖、糖尿病、甲狀腺功能亢進等代謝性疾病的核心特征之一，同時此過程貫穿于糖尿病等大多代謝類疾病的整個病程[4-5]。骨骼肌胰島素抵抗是糖脂代謝類疾病的早期特征之一，隨著異常的進展逐漸出現全身胰島素抵抗，嚴重的甚至引發系列心血管疾病[6]。PGC-lα是一種高度保守的核轉錄共激活因子，可促進脂粒氧化，以維持持久的肌肉收縮與能量供應，因此與線粒體功能和胰島素抵抗關系密切[7]。SIRT1是一種多功能轉錄調節因子，與胰島素敏感性、脂肪儲存與代謝以及葡萄糖的利用相關[8]。SIRT1和PGC-1α在機體內通過能量信號軸相互作用，PGC-1α通過對SIRT1抑制劑煙酰胺或經轉錄共激活劑實現在乙酰化過程中的增強[9-10]，以達到調節胰島素對糖脂代謝的影響。

通經調臟針法為長白山通經調臟手法流派經典針刺手法，經劉冠軍、李一清、紀青山、王之虹、王富春、劉明軍等幾代針灸名家總結傳承，現已證明對胰島素抵抗、肥胖、失眠等具有很好的臨床療效[11-14]，該針刺手法以中醫基礎理論為基礎，緊密結合子午流注及天干地支對應臟腑時間，以腹部為主，四肢部、頭部為輔。“合募配穴”針刺為其中具有取穴精簡、操作簡易、效果顯著，可標準化傳播，無明顯疼痛應激副作用等特點的針刺方法之一。深入探索并揭示該針刺方法的生物效應機制，對針刺治療OIR相關疾病具有重要意義。為探討“合募配穴”針刺治療OIR狀態的作用及其機制，本實驗采用雄性SD大鼠建立OIR模型，應用“合募配穴”針法進行干預，旨在探討手法針刺是否通過調節SIRT1/PGC-1α信號通路來調節增加骨骼肌PGC-1α蛋白的表達以改善OIR大鼠的胰島素抵抗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

選用SPF級8周齡雄性SD大鼠46只，體質量（220±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2018-003】；實驗動物合格證編號44007200034600，SPF狀態下隔離基礎飼料飼養，動物實驗倫理審批號：2021171。

1.1.2試劑與儀器

SIRT1激動劑白藜蘆醇（80051933）購自Celex Laboratories公司；光學顯微鏡（BX51型）購自日本OLYMPUS公司；胰島素檢測試劑盒、酶聯免疫試劑盒均購自長春昊誠生物科技有限公司；PureLink?RNA微量提取試劑盒（12183016）、RevertAid RT逆轉錄試劑 盒（K1691）及CellsDirect?qRT-PCR試 劑 盒（11753100）均購自購自Thermo Fisher SCIENTIFIC公司；qPCR儀購自Stratagene公司，Hwato/華佗牌單支平柄針0.18×13 mm購自蘇州醫療用品廠有限公司。

1.2 方法

1.2.1肥胖胰島素抵抗模型建立

采用經典高脂高糖飼料誘導聯合小劑量STZ腹腔注射，操作時模型組肥胖大鼠按25 mg·kg-1注射STZ溶液，空白組注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液[10]。采用評價胰島素對葡萄糖作用的“金標準”——高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗，判斷是否造模成功[15]。

1.2.2分組

根據完全隨機化法從46只大鼠中選取10只大鼠作為空白組，喂養基礎飼料；剩余36只高脂高糖飼料誘導聯合小劑量STZ（25 mg·kg-1）腹腔注射，剔除死亡的OIR大鼠，將造模成功的大鼠按照區組隨機化法隨機分成手法針刺組、模型組、白藜蘆醇激動劑組，每組僅保留10只大鼠。

手法針刺組大鼠隨即接受“合募配穴”針刺干預。將大鼠固定在固定架上，參考《獸醫針灸學》[16]及《實驗針灸學》[17]定位，分別針刺中脘（CV12）、天樞（ST25）、足三里（ST36）穴位，術中進針2 mm，采用捻轉手法操作。捻轉范圍為360°，頻率為120-160次/min。每個針刺點操作1 min，留針15 min，在此期間每5 min扭轉1次。治療1次/天。空白組、激動劑組和模型組不做針刺處理，但同樣抓取固定15 min，以確保它們暴露在與手法針刺組相同的處理和固定條件下。治療持續5次/周，每次于8：00-10：00之間治療，干預-4周，治療期間三組繼續高脂高糖飼料喂養。

1.2.4標本留取

在干預第4周末開始禁食不禁水12 h，于次日開始采集標本，用3%水合氯醛腹腔注射1 mL/100 g將大鼠麻醉，心尖取血，采血量3-4支生化黃管，約15 mL，離心后取上層血清靜置EP管中，置于-80℃冰箱保存備用。取血結束后，迅速打開腹腔，剖取肝臟、胰臟，稱肝臟濕重，并取股四頭肌，以上組織各取一半置于放有福爾馬林溶液的50 mL痰盒中固定[10]，另一部分分別采用錫紙包好編號，且每一只大鼠組織置于同一尼龍絲襪中迅速放入液氮罐備用。

1.2.5指標檢測

Western blotting檢測SIRT1和PGC-1α蛋白表達水平。取適量的股四頭肌骨骼肌組織，提取總蛋白后，取80μL的樣品與20μL的5倍樣品處理液混合。制備RhoA兔抗大鼠（Ab86297，Abcam）和ROCK2兔抗大鼠（Ab71598，Abcam）一抗。GAPDH作為內參照（1∶1000，兔抗鼠；Ab9484，Abcam）。在37℃復溫30 min后，用含吐溫20的Tris-Buffer生理鹽水（TBST）清洗3次，然后孵育。用TBST洗滌后，加入增強化學發光劑（ECL）。樣品在Sage Creation凝膠成像系統中顯影并曝光，每組Western blotting條帶重復做3次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 Lee's指數、胰島素抵抗指數（IRI）、胰島素敏感性指數（ISI）的表達

Lee's指數是評價成年大鼠肥胖程度方面的有效指數；胰島素抵抗指數（IRI）是評價胰島素靶器官利用葡萄糖的能力；胰島素敏感性指數（ISI）是描述胰島素抵抗的程度，胰島素敏感性越低，單位胰島素的效果越差，分解糖類的程度越低。為觀察“‘合募配穴’針刺”對OIR大鼠糖脂代謝的生物效應，對比實驗干預4周后各組大鼠Lee's指數、IRI、ISI變化情況，具體見圖1。

圖1 干預4周后各組大鼠Lee's指數、IRI、ISI相對表達情況

與空白組相比，模型組Lee's指數、IRI顯著增加，ISI顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，手法針刺組和激動劑組Lee's指數、IRI顯著下調，ISI明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）；手法針刺組和激動劑組相比，Lee's指數、IRI、ISI均無明顯變化，無統計學差異（P＞0.05）。提示“合募配穴”針刺可提高肥胖糖尿病大鼠胰島素敏感性，改善胰島素抵抗狀態，同時改善大鼠肥胖程度。

2.2 骨骼肌光鏡的改變

干預4周后，各組大鼠骨骼肌光鏡改變見圖2。可見空白組大鼠骨骼肌細胞數量正常，肌纖維細長，呈平行排列，同時內部可見形態飽滿橢圓形或圓形細胞核；模型組大鼠骨骼肌肌纖維萎縮變性，可見間質脂肪增生，部分區域有壞死、水腫；手法針刺組和激動劑組骨骼肌細胞形態尚可，但形態還較空白組水平差，且兩組之間未見明顯差異。提示通經調臟手法針刺可改善肥胖糖尿病大鼠骨骼肌組織病理狀態。

圖2 各組大鼠骨骼肌組織病理改變光鏡圖（HE×200）

2.3 骨骼肌組織SIRT1與PGC-1α mRNA表達水平的改變

干預4周后，各組大鼠骨骼肌組織SIRT1與PGC-1α mRNA表達水平的改變情況見圖3。與空白組相比，模型組SIRT1與PGC-1α mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，手法針刺組和激動劑組PGC-1α mRNA表達水平明顯提高（P＜0.05，P＜0.01）；與激動劑組相比，手法針刺組SIRT1與PGC-1α mRNA表達水平無顯著性差異，無統計學意義（P＞0.05）。提示通經調臟手法針刺可調節SIRT1/PGC-1α信號通路提高肥胖糖尿病大鼠骨骼肌組織SIRT1與PGC-1α mRNA表達水平。

圖3 各組大鼠骨骼肌組織SIRT1與PGC-1α mRNA相對表達水平情況

2.4 骨骼肌組織SIRT1與PGC-1α蛋白表達水平的改變

干預4周后，各組大鼠骨骼肌組織SIRT1與PGC-1α蛋白表達水平的改變情況見圖4。與空白組相比，模型組SIRT1與PGC-1蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，手法針刺組和激動劑組PGC-1α蛋白表達水平明顯提高（P＜0.05，P＜0.01）；與激動劑組相比，手法針刺組SIRT1與PGC-1α蛋白表達水平無顯著性差異，無統計學意義（P＞0.05）。提示通經調臟手法針刺可調節SIRT1/PGC-1α信號通路提高OIR大鼠骨骼肌組織SIRT1與PGC-1α蛋白表達水平。

圖4 各組大鼠骨骼肌組織SIRT1與PGC-1α蛋白相對表達水平

3 討論

OIR致病率高、并發癥多，往往繼發代謝綜合征、Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、高血壓病、脂肪肝和諸多癌癥，是人類健康的最大潛在威脅。OIR是一個多因素相互影響并共同作用的疾病狀態，胰島素敏感性降低，血糖代謝異常是引起肥胖和胰島素抵抗的重要原因，也是造成骨骼肌組織損傷的始動因素。現代治療多以奧利司他、鹽酸二甲雙胍緩釋片等西藥治療為主，出現腹瀉、惡心、心慌、食欲減退等一系列副作用，長期服用會出現繼發性失效現象[18]。作為中醫外治法的手法針刺，經過千百年的臨床實踐總結，特別是通經調臟手法針刺，將先天八卦和后天八卦的辨位思想及天干地支、子午流注的時效生克思維有效結合，已證實在治療OIR方面有獨特的療效[19-21]，同時具有無毒副作用的優點[18]。

該針刺取穴遵循“合募配穴”將六腑的下合穴與本經的募穴配，通過針刺持續刺激天樞、中脘、足三里等腧穴，足三里為足陽明經下合穴，合治內腑主燥化脾濕，生發胃氣，增強脾胃功，重在通降；中脘為胃之募，腑之會，又系任脈、手足陽明、太陰、少陽之會所，故針刺該穴可以達到疏利氣機、補益中氣、疏理中氣之效，加快腸胃蠕動、加速代謝[22]；天樞穴作為手陽明大腸經募穴，是陽明脈氣所發，主疏調腸腑，具有理氣、行滯、消食的作用，針刺該穴可以顯著改善腸腑功能。由此可見合募配穴，一升一降，相互配合，協調縱橫，通調氣機，陰陽接續，相互協調，增強臨床療效。又足陽明為后天氣血生化之根本，水谷之海、五臟六腑之海，具有生化氣血，滋養表里之功效，故針刺腹部胃經穴位有助氣血生化，加強五臟六腑的功能，促進體內毒素代謝，調節脂肪消耗[19]。任脈為“臍下腎間動氣”所在，刺激任脈腧穴關元、中脘等穴位，通過調節督、任、沖三脈之經氣，平衡全身經氣運行，以恢復脾胃健運之功效。因此使用“合募配穴”針刺的針刺組干預后的肥胖胰島素抵抗大鼠Lee’s指數、IRI水平與模型組比較，顯著下降，ISI有所增強（P＜0.05）；光鏡下骨骼肌細胞生物形態結構尚可，但較空白組生物完整性差，且兩組之間未見明顯差異，也說明了“合募配穴”針刺通過刺激穴位作用相關經絡及臟腑可調節OIR大鼠胰島素抵抗狀態，改善骨骼肌組織病理損傷。

在諸多胰島素抵抗相關的基礎研究中，已經證明了機體發生胰島素抵抗的標志包括骨骼肌內甘油三酯的沉積[23-24]。胰島素抵抗時，機體骨骼肌內葡萄糖有氧氧化從正常的增多轉變為減少。現代許多研究證實，調控細胞能量輸出的信號網絡由SIRT1和PGC-1α形成，骨骼肌細胞能量代謝和SIRT1/PGC-1α信號通路聯系密切相關，高糖環境刺激導致的氧化應激過程中均檢測到SIRT1/PGC-1α表達下調，從而導致相關細胞線粒體氧化供能減少，可使得骨骼肌等細胞損傷，加重糖代謝紊亂，造成肥胖等并發癥進程加快[25-30]。研究表明白藜蘆醇可作為SIRT1相關研究的激動劑，且顯著上調SIRT1/PGC-1α號通路的表達[30-32]。作為Sirtuins蛋白家族最具代表性的因子，SIRT1位于細胞核具有脫乙酰化酶的活性，其乙酰化可以作用于組蛋白、轉錄調節因子或者其他蛋白進行修飾，調控基因的表達，主要有抑制細胞凋亡、能量代謝、抗炎和抗氧化應激調節等多種生物調節作用[33]。多項研究表明，激發SIRT1的正常表達不僅可以減輕細胞損傷和凋亡，更可以調控能量代謝等多種相關信號通路以保持細胞和器官的正常功能[34-37]。

本實驗研究表明，在OIR模型大鼠中，SIRT1表達較空白組大鼠顯著減少，而增加“合募配穴”手法針刺可上調OIR模型大鼠SIRT1表達水平，調控胰島素敏感度，從而促進骨骼肌細胞能量代謝。PGC-1α主要分布在心臟、骨骼、脂肪組織、腎臟及肝臟等高能量需求且富含線粒體的組織中，刺激相關器官細胞中線粒體的能量代謝中間產物合成以及增強線粒體的能量代謝能力是其關鍵生物學功能[25,38-39]。實驗觀察到OIR模型大鼠骨骼肌組織PGC-1α表達顯著減少，而手法干預治療4周后大鼠的PGC-1α表達水平顯著增加（P＜0.05），其通過提高線粒體的氧氣結合功能、氧化磷酸化相關酶的活力促進線粒體中的生物合成[40-41]。體內研究證實，骨骼肌肌肉特異性PGC-1α過表達可以促進mtDNA轉錄及線粒體呼吸鏈酶的活性。Lakshmanan等[42]在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中亦觀察到PGC-1α表達的減少。由此可見，PGC-1α表達水平的上升可調節線粒體的呼吸功能、氧化磷酸化相關酶的活力，從而刺激線粒體的生物合成，恢復能量代謝穩態，減輕骨骼肌細胞的氧化應激反應。

綜上，基于“合募配穴”的手法針刺可上調OIR骨骼肌組織的SIRT1及PGC-1α表達水平，改善骨骼肌細胞病理傷損，胰島素敏感性，同時有效降低Lee's指數，抑制氧化應激，從而減輕體重，達到改善胰島素抵抗狀態的目的。該實驗研究推測OIR與骨骼肌細胞能量代謝相關信號通路異常密切相關，為進一步探究手法針刺治療OIR的機制提供了新的研究思路，同時為其減藥治療提供干預手段參考。

1邵燦燦,張國豪.飲酒對胰島素抵抗的影響及其機制的研究進展.重慶醫學,2017,46(13):1855-1857,1859.

5甄云鳳,馮靜,唐勇,等.MicroRNA-802對胰島素抵抗的骨骼肌細胞PI3K/Akt通路的影響.解放軍醫學雜志,2020,45(8):798-803.