電針聯(lián)合跑輪訓(xùn)練對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經(jīng)及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響＊

廖 恒，郭俐宏，高玉姣，穆敬平

（十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院 十堰 442000）

腦卒中是由于腦血管破裂或血管阻塞導(dǎo)致的腦組織進(jìn)行性損傷的疾病，包括缺血性和出血性卒中，有較高發(fā)病率、致殘率及死亡率[1]。臨床資料顯示，缺血性腦卒中占腦卒中的87%，是我國(guó)成年人殘疾和死亡的首要原因[2-3]。目前常見的治療方法是及時(shí)恢復(fù)腦血流，然而臨床上部分患者在大腦恢復(fù)供血后因腦缺血引發(fā)的神經(jīng)功能障礙不僅未能減輕，腦缺血后腦水腫和繼發(fā)性神經(jīng)功能損傷的發(fā)生率反而進(jìn)一步增多，表現(xiàn)出復(fù)雜的病理生理改變，如炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、自噬或血腦屏障破壞并最終導(dǎo)致大量大腦神經(jīng)元死亡、臨床則表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，此即預(yù)示著腦缺血再灌注（cerebral ischemiareperfusion,CIR）損傷已然發(fā)生[3-4]。基于CIR的病理過程，缺血性腦卒中治療的根本在于血液再通后預(yù)防腦缺血再灌注損傷，改善患者神經(jīng)功能[5]。研究表明，電針療法可以保護(hù)腦缺血再灌注受損的神經(jīng)細(xì)胞，改善CIR大鼠神經(jīng)功能損傷[6]；電針“水溝”穴具有腦保護(hù)作用，可提高CIR模型大鼠學(xué)習(xí)能力[7]；而跑臺(tái)訓(xùn)練可促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)和運(yùn)動(dòng)功能重建[8]。為避免或降低臨床治療過程中局部腦組織發(fā)生缺血缺氧性壞死及再通后再灌注損傷神經(jīng)加重，及時(shí)的干預(yù)具有重要意義。本項(xiàng)目基于上述研究成果的基礎(chǔ)上，將兩種方法結(jié)合起來并增加同樣具有醒腦開竅的“百會(huì)、神庭”，對(duì)觀察大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）CIR損傷模型大鼠神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)功能重建之間的關(guān)系具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠50只，56日齡，體質(zhì)量（235±5）g。動(dòng)物購自武漢市萬千佳興生物科技有限公司，許可證：SCXK（鄂）2017-0008。動(dòng)物的使用符合3R原則，實(shí)驗(yàn)期間滿足動(dòng)物福利，飼養(yǎng)間濕度60-70%，恒溫：22-24℃。自然采光，動(dòng)物飼養(yǎng)普通飼料、自由飲水。

1.2 主要儀器與試劑

LH202H型四導(dǎo)韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華運(yùn)安特）；0.25 mm×25 mm毫針（蘇州醫(yī)療用品廠）；JBPL型大鼠跑輪（淮北九百電子科技有限公司）；NeuroExam M-800型肌電圖/誘發(fā)電位儀購自珠海市邁康科技有限公司（型號(hào)：NeuroExam M-800A）；SpectraMax Paradigm多功能酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀（美谷分子儀器（上海）有限公司）；BL-410N生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟）；戊巴比妥鈉購自揚(yáng)州市奧鑫助劑廠（批號(hào)：302-17-0）；Evans Blue伊文思藍(lán)（上海懋康生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1模型制備及分組

選取10只體重相近的設(shè)為假手術(shù)組，將另40只參照Longa線栓法制作CIR模型[9-10]，具體步驟如下：術(shù)前不禁水但禁食12 h。動(dòng)物經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）麻醉，待動(dòng)物完全麻醉后仰位固定于鼠板，剪去頸部鼠毛后碘伏消毒。于頸前正中線右側(cè)0.3 mm縱行切開皮膚（長(zhǎng)約2 cm），鈍性分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈近心端并夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在緊靠頸內(nèi)動(dòng)脈近心端剪口后用栓線小心插入，當(dāng)栓線到達(dá)頸內(nèi)動(dòng)脈至阻斷頸內(nèi)動(dòng)脈血流動(dòng)脈夾夾閉處時(shí)，松開微動(dòng)脈夾，繼續(xù)緩慢推進(jìn)18-20 mm出現(xiàn)明顯的阻力感即表明栓線已插入顱內(nèi)至大腦前動(dòng)脈并恰好堵塞大腦中動(dòng)脈開口；栓線阻斷供血2 h后將栓線頭端退至頸總動(dòng)脈復(fù)灌，剪去多余栓線，縫合皮膚[6,9-10]。假手術(shù)組除不插栓線外，完成造模相同手術(shù)。待麻醉清醒后6 h時(shí)參照改良Zea-Longa神經(jīng)功能缺損評(píng)分（0-7分）評(píng)價(jià)、判斷模型是否成功。以評(píng)分為1-6分的納入本研究。造模后假手術(shù)組全部存活，40只進(jìn)行造模手術(shù)的死亡5只，3只不符合模型標(biāo)準(zhǔn)，32只大鼠符合標(biāo)準(zhǔn)，成功率為（80%）；分組：假手術(shù)組10只，將符合模型標(biāo)準(zhǔn)的32只大鼠編號(hào)后采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)均分為模型組、電針組、跑輪組和電針+跑輪組，每組8只。

1.3.2治療

各組治療均于術(shù)后第2天進(jìn)行。大鼠在清醒狀態(tài)下固定于鼠臺(tái)，電針組參考《華興邦大鼠穴位圖譜》取“百會(huì)、神庭、水溝”穴。用0.25 mm×25 mm針灸針提插捻轉(zhuǎn)后接電25 min，給予2 Hz/15 Hz的疏密波（疏波：2 Hz；密波：15 Hz）、電流強(qiáng)度為2 mA的電刺激，并以穴位周圍肌肉輕微抖動(dòng)為度[6]。1次/天，25 min/次。跑輪組于籠中配置JB-PL型自主跑輪，大鼠自主上輪跑步，通過紅外線檢測(cè)裝置和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄每日跑步距離、速度和時(shí)間[11]。電針+跑輪組治療同電針組和跑輪組。治療共4周，5次/周。模型組、假手術(shù)組不予治療。

1.3.3神經(jīng)及運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估

治療結(jié)束后（4周）開始評(píng)估。①Zea-Longa神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：術(shù)后大鼠無任何不對(duì)稱活動(dòng)；1分：提尾時(shí)大鼠左前爪不能完全伸展；2分：左前肢活動(dòng)障礙為主；3分：左前肢緊貼胸壁；4分：自由活動(dòng)時(shí)向左側(cè)偏轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)彎；5分：左前爪伴有明顯的后推動(dòng)作；6分：圍繞停留點(diǎn)旋轉(zhuǎn)；7分：大鼠左側(cè)肢體完全不能支撐身體，躺向左側(cè)或甚至意識(shí)喪失[9-10]。②懸吊試驗(yàn)：主要評(píng)價(jià)肢體肌力和軀體平衡功能，實(shí)驗(yàn)時(shí)將鼠前爪搭在離桌面45 cm鐵絲上記錄懸吊時(shí)間。③Grip test評(píng)分可評(píng)估運(yùn)動(dòng)功能協(xié)調(diào)性。記分標(biāo)準(zhǔn)：松手后以不能懸吊于鐵絲、跌落評(píng)定為0分：一只或兩只前爪可緊握鐵絲記1分；試圖爬上鐵絲記2分；一只或兩只前爪和一只或兩只后爪緊握鐵絲記3分；前爪和后爪緊握鐵絲和尾巴纏繞鐵絲記4分；逃跑記5分[12]。

1.3.4經(jīng)皮層電刺激運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（motor evoked potential,MEP）檢測(cè)

于治療1周時(shí)，經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，俯臥位固定于腦立體定位儀。顱骨鉆孔暴露硬腦膜（前囟后l mm，矢狀縫旁開1 mm），銀球刺激電極與硬腦膜接觸（骨科水泥封閉固定便于2周、3周、4周實(shí)驗(yàn)記錄）；參考電極安放于硬腭粘膜下，左小腿腓腸肌接雙極銀針參考和記錄電極，腰部固定地線，采用刺激強(qiáng)度：25 mA，波寬：1 ms，頻率：40 Hz的單個(gè)方波電脈沖刺激50次[13]。

1.3.5伊文思藍(lán)滲透實(shí)驗(yàn)

MEP檢測(cè)結(jié)束后（4周）從大鼠股靜脈注射2%伊文思藍(lán)溶液（4 mL·kg-1）。2 h后斷頭處死，快速取腦組織浸入甲酰胺溶液（10 mL·g-1）中10 min，研磨、勻漿，60℃孵育24 h，離心機(jī)離心半徑設(shè)為7 cm，4 000 r/min離心15 min。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置為520 nm，測(cè)量上清液的光密度（optical density,OD）值，根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后取讀取伊文思藍(lán)濃度以評(píng)價(jià)血腦屏障通透性[14]。

1.3.6腓腸肌實(shí)驗(yàn)

取腓腸肌2 cm（4周），接張力傳感器和BL-410N生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，場(chǎng)刺激增量設(shè)置為0.1 mm，逐步刺激以記錄等長(zhǎng)收縮肌力[15]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS Statistics 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能評(píng)估

表1顯示，與假手術(shù)組相比，模型組Zea-Longa評(píng)分提高，Grip test和懸吊時(shí)間均降低（P＜0.05）。與模型組相比，電針組和跑輪組Zea-Longa評(píng)分均較模型組降低，Grip test和懸吊時(shí)間較模型組提高（P＜0.05）。但電針組Zea-Longa、Grip test和懸吊時(shí)間均低于跑輪組（P＜0.05）。而電針+跑輪組Zea-Longa評(píng)分均低于電針組和跑輪組，Grip test和懸吊時(shí)間高于電針組和跑輪組（P＜0.05）。

表1 大鼠運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能評(píng)估結(jié)果比較（±s）

表1 大鼠運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能評(píng)估結(jié)果比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與電針組比較，#P＜0.05；與跑輪組比較，&P＜0.05。

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2.2 大鼠MEP記錄結(jié)果

表2顯示，模型組MEP潛伏期較假手術(shù)組同期明顯延長(zhǎng)、波幅峰值較假手術(shù)組同期降低（P＜0.05）。與模型組同期相比，電針組和跑輪組MEP各時(shí)相點(diǎn)潛伏期明顯降低、波幅峰值升高（P＜0.05）。且電針組MEP各時(shí)相點(diǎn)波幅峰值均高于跑輪組同期水平，潛伏期低于跑輪組同期水平（P＜0.05）。與電針組同期水平和跑輪組同期水平相比，電針+跑輪組MEP各時(shí)相點(diǎn)潛伏期明顯降低、波幅峰值升高（P＜0.05）。

表2 大鼠各時(shí)相點(diǎn)MEP變化比較（±s）

表2 大鼠各時(shí)相點(diǎn)MEP變化比較（±s）

注：與假手術(shù)組同期比較，△P＜0.05；與模型組同期比較，▲P＜0.05；與電針組同期比較，#P＜0.05；與跑輪組同期比較，&P＜0.05。

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2.3 腓腸肌實(shí)驗(yàn)和伊文思藍(lán)滲透實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3顯示，模型組等長(zhǎng)收縮肌力較假手術(shù)組降低，伊文思藍(lán)含量較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，跑輪組、電針組等長(zhǎng)收縮肌力提高，伊文思藍(lán)含量明顯降低（P＜0.05）。跑輪組等長(zhǎng)收縮肌力高于電針組（P＜0.05），但2組伊文思藍(lán)含量?jī)蓛杀容^差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與電針組和跑輪組相比，電針+跑輪組等長(zhǎng)收縮肌力提高，伊文思藍(lán)含量明顯降低（P＜0.05）。

表3 大鼠腓腸肌張力和伊文思藍(lán)含量結(jié)果比較（±s）

表3 大鼠腓腸肌張力和伊文思藍(lán)含量結(jié)果比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與電針組比較，#P＜0.05；與跑輪組比較，&P＜0.05。

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3 討論

大腦組織的能量消耗占全身耗氧量20%以上，是能量消耗最大的器官，也是學(xué)習(xí)記憶的最重要、最高級(jí)和最基本的神經(jīng)單元[16]。維持腦組微環(huán)境穩(wěn)態(tài)并保證其正常功能的基本結(jié)構(gòu)是血腦屏障，也是維持腦微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、保證其正常功能的特殊結(jié)構(gòu)，CIR后發(fā)生的氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮損傷是造成血腦屏障完整性被破壞的主要因素，血腦屏障完整性被破壞后血腦屏障通透性發(fā)生改變，故改善或維持血腦屏障的完整性可能是防止腦缺血再灌注損傷的關(guān)建[17-18]。研究表明，當(dāng)血腦屏障因缺血再灌注而遭受破壞時(shí)，伊文思藍(lán)與白蛋白結(jié)合后隨之滲漏至腦組織中，故伊文思藍(lán)是目前評(píng)價(jià)大鼠腦缺血再灌注損傷血腦屏障通透性的可靠指標(biāo)，伊文思藍(lán)含量降低則預(yù)示血腦屏障完整性得以恢復(fù)[14,19]。

在本實(shí)驗(yàn)中，電針組和跑輪組伊文思藍(lán)含量?jī)蓛杀容^差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但電針+跑輪組伊文思藍(lán)含量明顯低于電針組或跑輪組，提示電針和跑輪均有肋于改善血腦屏障通透性，且二者結(jié)合在維持血腦屏障完整性方面要優(yōu)于單獨(dú)的電針或跑輪訓(xùn)練，這也進(jìn)一步證實(shí)血腦屏障通透性改變可能是腦缺血再灌注損傷發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，而維持血腦屏障完整性可能是電針結(jié)合跑輪訓(xùn)練促康復(fù)作用的關(guān)鍵因素。另外，電針組MEP各時(shí)相點(diǎn)波幅峰值高于跑輪組，Zea-Longa及MEP各時(shí)相點(diǎn)潛伏期低于跑輪組，提示電針“百會(huì)、神庭、水溝”穴有利于CIR模型大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)功能重建，其神經(jīng)功能恢復(fù)要優(yōu)于跑輪訓(xùn)練。MEP可客觀體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能完整性及傳導(dǎo)通路功能狀態(tài)，通過記錄皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)突觸傳遞及軸索傳導(dǎo)功能，可準(zhǔn)確反應(yīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)通路功能狀態(tài)、興奮性及功能損傷范圍[13]。臨床應(yīng)用方面，MEP與腦缺血神經(jīng)功能受損的程度及運(yùn)動(dòng)功能缺失相關(guān)、也可客觀反應(yīng)大腦運(yùn)動(dòng)信號(hào)皮層下傳導(dǎo)功能、對(duì)判斷臨床預(yù)后有一定的意義[20]。研究表明，生理或病理狀況下，電針均具有調(diào)節(jié)大腦運(yùn)動(dòng)皮層興奮性的作用[21]。“水溝穴”電針可抑制缺血后腦動(dòng)脈血管平滑肌痙攣并增加腦梗死區(qū)周圍血流灌注[22]。電針“百會(huì)、神庭穴”可改善腦缺血再灌注損傷后認(rèn)知障礙模型大鼠認(rèn)知功能[23]。MEP各時(shí)相點(diǎn)波幅峰值升高、潛伏期降低，說明中樞運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)時(shí)間縮短、神經(jīng)傳導(dǎo)速度加快[24]。電針還可減少腦出血量，減輕腦缺血再灌注損傷、顯著促進(jìn)卒中大鼠促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[25]。另有研究顯示，認(rèn)知損害與運(yùn)動(dòng)功能有重要聯(lián)系，認(rèn)知受損程度與功能障礙相互關(guān)聯(lián)，也與康復(fù)結(jié)局關(guān)聯(lián)，良好及時(shí)的認(rèn)知訓(xùn)練可促進(jìn)上肢功能恢復(fù)[26]。而針刺可改善腦卒中后上肢痙攣且有一定遠(yuǎn)期臨床療效[27]。分析認(rèn)為，電針對(duì)于增加大鼠CIR后缺血區(qū)血流量，緩解血管及肌肉痙攣、改善CIR后上、下肢運(yùn)動(dòng)功能也有積極作用。實(shí)驗(yàn)選用的“百會(huì)、神庭、水溝”穴為傳統(tǒng)醒腦開竅要穴，電針輸出與人體生物電相似的微量低頻脈沖電流，在合理、固定的電流刺激下，產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)信號(hào)能更好地調(diào)理經(jīng)絡(luò)之氣，增加組織灌注、刺激受損腦組織“覺醒”[28]。總之，從MEP各時(shí)相點(diǎn)變化規(guī)律中可以看出，CIR模型大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮層的興奮性逐步提高，這可能是電針調(diào)節(jié)大腦運(yùn)動(dòng)皮層興奮性進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵。

缺血性腦卒的另一最常用的治療方法為運(yùn)動(dòng)療法。而不同的運(yùn)動(dòng)方法可增加肌力和協(xié)調(diào)性、改善恢復(fù)期腦卒中患者上肢、下肢運(yùn)動(dòng)功能，平衡功能、本體感覺等[29]。運(yùn)動(dòng)可改善腦缺血再灌注模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能[30]。還可維持血腦屏障完整性并減少腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損[14,31]。本實(shí)驗(yàn)觀察到跑輪組Grip test評(píng)分、懸吊時(shí)間和等長(zhǎng)收縮肌力均高于電針組，提示跑輪訓(xùn)練可促進(jìn)CIR模型大鼠骨骼肌重塑和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，其運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)要優(yōu)于電針。為達(dá)到認(rèn)知與運(yùn)動(dòng)功能重建的目的，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合電針和跑輪訓(xùn)練各自的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)CIR模型大鼠同時(shí)進(jìn)行電針和跑輪訓(xùn)練，以期在促進(jìn)神經(jīng)功能重建的同時(shí)，有針對(duì)性的進(jìn)行運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性訓(xùn)練。結(jié)果在電針+跑輪組中，二種方法出現(xiàn)協(xié)同作用。如我們觀察到Zea-Longa評(píng)分，懸吊時(shí)間均較單獨(dú)治療方法（電針或跑輪）延長(zhǎng)，MEP各時(shí)相點(diǎn)潛伏期降低，而Grip test評(píng)分、MEP各時(shí)相點(diǎn)波幅峰值及等長(zhǎng)收縮肌力均較單獨(dú)治療方法提高。這提示電針有利于神經(jīng)傳導(dǎo)功能重建，跑輪訓(xùn)練可促進(jìn)CIR模型大鼠骨骼肌重塑和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

綜上所述，本研究提示電針有利于神經(jīng)傳導(dǎo)功能重建，跑輪訓(xùn)練可促進(jìn)CIR模型大鼠骨骼肌重塑和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，在治療腦缺血再灌注損傷時(shí)二者具有協(xié)同作用。跑輪訓(xùn)練和電針治療都可能通過改變CIR模型大鼠血腦屏障通透性而增加腦組織供能，這在一定程度上有利于減輕腦缺血再灌注損傷這一復(fù)雜病理過程中造成的腦損傷。同時(shí)，二者聯(lián)合對(duì)于提高CIR模型大鼠骨骼肌肌力、增強(qiáng)肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性并促進(jìn)整體運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能恢復(fù)有利。