大腸桿菌ESBLs基因克隆表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

摘要：大腸桿菌是一種最常見的革蘭氏陰性菌，是一種常見的條件性致病菌。由于在治療大腸桿菌時抗生素的大量使用，使大腸桿菌產(chǎn)生了很多耐藥基因，其中超廣譜β -內(nèi)酰胺酶對許多p-內(nèi)酰胺類抗生素具有耐藥性，且以其中的CTX-M型為主，為了更好地研究產(chǎn)超廣譜β -內(nèi)酰胺酶，本次實驗通過設(shè)計并擴(kuò)增產(chǎn)超廣譜p-內(nèi)酰胺酶的CTX-M-3基因，并通過Ndel、XhoI兩種限制性內(nèi)切酶酶切并連接，預(yù)計構(gòu)建pET42b-ESBLs的原核表達(dá)載體，并送往上海生工公司進(jìn)行測序，并對測序結(jié)果的遺傳相似性及遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析，由于引物的特異性或模板的特殊性，測序結(jié)果顯示擴(kuò)增結(jié)果為DH5a染色體基因組并構(gòu)建的載體是DH5a染色體基因的原核表達(dá)載體。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；超廣譜β -內(nèi)酰胺酶；PCR擴(kuò)增；CTX-M

大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界中尤其是人與動物腸道中，可以在腸道內(nèi)引起各種病理性感染。大腸桿菌的耐藥性使得這些感染的治療變得困難，大腸桿菌的耐藥性在不斷地發(fā)展，在大腸桿菌的多種耐藥基因中，超廣譜β一內(nèi)酰胺酶（Extend-ed-spectrum β -lactamase，ESBLs）引起了廣泛的關(guān)注。產(chǎn)超廣譜β -內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌對許多β一內(nèi)酰胺類抗生素具有耐藥性，包括青霉素、氨曲南和大多數(shù)頭孢菌素[1]。由于耐藥性的存在，在使用抗生素后，大腸桿菌還是會出現(xiàn)在人或動物的腸道中[2]。大腸桿菌通常通過糞便一口腔途徑傳播[3]，多種耐藥型ESBLs大腸桿菌可通過與人、動物或環(huán)境接觸，或攝入受污染的食物或水傳播[4]。

大腸桿菌的ESBLs可分為SHV型、CTX-M型、TEM型、OXA型和其他型（VEB、GES、PER）5大類[5]。由于頭孢菌素類抗生素的廣泛使用，ESBLs大腸桿菌耐藥程度也不斷加重，且以CTX-M型耐藥基因為主，TEM型和SHV型耐藥基因次之[6-7]。目前，在全世界范圍內(nèi)，已經(jīng)有超過200種ESBLs基因型的存在。而且產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌對一些抗菌類藥物有著較強(qiáng)的抵抗能力，我國的產(chǎn)ESBLs菌株主要是分解頭孢噻肟的CTX-M型[8]很大程度上影響了臨床治療的效果，本實驗擬通過擴(kuò)增ESBLs基因的并構(gòu)建pET-42b-ESBLs原核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究ESBLs基因及其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體

pET-42b載體、大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞及大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞均由塔里木大學(xué)重點實驗室保存。

1.2 主要試劑

核酸染料Golden View購自博邁德生物公司，DNA Marker、Easy Taq mix酶、Xho l、Nde I內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自全式金生物技術(shù)有限公司，通用型DNA純化回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京天根生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GeneBank中已公布的CTX-M-3的基因序列（登錄號：AB168117.1），使用SnapGene軟件設(shè)計特異性引物，上、下游引物分別加上Nde I、Xho I兩個酶切位點，并添加相應(yīng)的保護(hù)性堿基，由SnapGene軟件預(yù)測出構(gòu)建載體圖譜（圖1），引物序列（表1），預(yù)計片段大小為876bp。引物由上海生工公司合成。

1.4 ESBL基因擴(kuò)增

使用大腸桿菌的疫苗株作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系25μL：2×Easy Taq mix酶12. 5μL，上、下游引物各1μL，模板1μL，ddH20 9. 5μL。反應(yīng)體系：95℃預(yù)變性5min：95℃變性30s，53℃退火延伸30s，72℃延伸90s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10m in。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠回收。

1.5 ESBLs基因重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將pET-42b載體及擴(kuò)增產(chǎn)物用Xho I及Nde l兩個限制性內(nèi)切酶37。C酶切30min，并回收。將酶切完的載體及目的基因進(jìn)行同源重組，插入片段與載體摩爾比為3：1，連接反應(yīng)體系：載體1μL，目的片段3μL，10×ligation buffer 2μL，T4 DNA ligase 1μL，ddH2O 13UL。16。C水浴連接8h。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，挑選陽性菌落，經(jīng)過菌液PCR鑒定正確提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定后，將鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工公司進(jìn)行測序。

1.6 測序結(jié)果分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得CTX-M型、TEM型、OXA型和VEB型等15個基因序列，使用MegAI ig和Mega 11對測序結(jié)果進(jìn)行苷酸和氨基酸序列相似性比對和進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果

2.1 ESBLs基因PCR擴(kuò)增及原核表達(dá)載體的鑒定及表達(dá)

以疫苗株為模板對大腸桿菌ESBLs基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了約為876bp的目的條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果相同。對轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞后的陽性菌落進(jìn)行鑒定（圖3），對提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定（圖4）。

2.2測序結(jié)果分析

經(jīng)上海生工公司測序后發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不相符，使用DNAMAN將上下游引物與測序結(jié)果比對后發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果的上下游與引物相符（圖5，6），通過相似性對比發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與DH5a染色體基因相似性最高，與其他基因型相似性都低于50%（圖7），系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明與DH5 a染色體基因?qū)儆谝粋€分支關(guān)系最近，與大腸桿菌DH5 a衍生物基因NEB及ESBLs基因的不同類型親緣性較遠(yuǎn)（圖8）。

3 結(jié)論

最近幾年來由于一些抗生素大量且不合理使用導(dǎo)致耐藥菌株逐年增加，特別是產(chǎn)ESBLs菌引起的耐藥現(xiàn)象更為嚴(yán)重[9]且這些耐藥菌以CTX-M為主要耐藥基因型[10-12]。而被ESBLs導(dǎo)致的耐藥性研究也成為了研究大腸桿菌耐藥性的熱點[13]并且在動物源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌中以CTX-M型流行為主[14]，CTX-M基因型ESBLs其對頭孢噻肟的水解能力最高，同時可水解氨曲南和頭孢曲松，而對頭孢吡肟的水解力很弱[15]有研究顯示ESBLs主要存在于革蘭氏陰性桿菌中，包括肺炎并且克雷伯菌和大腸桿菌而且現(xiàn)在已經(jīng)成為介導(dǎo)革蘭陰性桿菌對新型廣譜β一內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的重要機(jī)制，而大腸桿菌則是產(chǎn)ESBLs的主要載體[16]。

因此本實驗主要是對大腸桿菌ESBLs基因進(jìn)行體外擴(kuò)增、克隆與測序及分析，希望可以為該病的進(jìn)一步研究以及防治工作、疫苗開發(fā)等方面提供參考。

在PCR過程中得到了與預(yù)期片段大小相似的片段，并對其進(jìn)行了酶切、菌液PCR鑒定均發(fā)現(xiàn)與預(yù)期片段大小相似，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定時也出現(xiàn)了質(zhì)粒片段及目的片段大小相似，但在測序后結(jié)果為DH5 a染色體基因，片段大小只相差120bp，在電泳圖中很難區(qū)分，只有在經(jīng)過測序后才能發(fā)現(xiàn)，原因可能是由于兩段序列的上下游序列太過于相似，導(dǎo)致擴(kuò)增出的基因發(fā)生了變化。

參考文獻(xiàn)：

[1] Paterson David-L.Bonomo Robert-A. Extended-spectrum beta-lactamases：a clinical update.[J] Clinical microbiology reviews. 2005 （4）： 657-686

[2] Marshall Bonnie-M.Levy Stuart-B. Food animals and antimicrobials： im-pacts on human health. [J]. Clinical microbiology reviews. 2011 （4）：718-733

[3]Russell J-B.Jarvis G-N. PTactical mechanisms for interrupting the oral-fecallifecycle of Escherichia coli. [J]. Joumal of molecular microbiology andbiotechnology. 2001 （2）： 265-272

[4]O'connor Ciara.Philip Roy-K.Kelleher John， et al_ The frrst occurrence of aCTX-M ESBL-producing Escherichia coli outbreak mediated by mother toneonate transmission in an Irish neonatal intensive care unit. [Z]. 2017： 16[5] Doi Yohei.lovleva Alina.Bonomo Roberl-A. The ecology of extend-ed-spectrum B -lactamases （ESBLs） in the developed world. [J]. Journal oftravel medicine. 2017 （suppl_l）： S44-S51

[6] Tadesse Daniel-A.Li Cong.Mukherjee Sampa. et al_Whole-Genome Se-quence Analysis of CTX-M Containing Escherichia coli Isolates from Re-tail Meats and Cattle in the United States. [J]. Microbial drug resistance（Larchmont.NY），2018 （7）： 939-948

[7] 陳偉，張永正，汪雪雁，等動物源性大腸桿菌ESBLs類耐藥基因與HPI基因的雙重PCR檢測及相關(guān)牲分析[J]中國獸醫(yī)科學(xué)，2013. 43 （8）：800-805

[8] 牛鑫鑫，馮濤，何紀(jì)元，等虎源大腸桿菌ESBLs基因型的檢測[J]野生動物學(xué)報，2019. 40（1）： 70-74

[9] 張立偉，朱陣，劉洋，等河北省雞源大腸桿菌CTX-M型ESBLs基因的流行特征研究[J]中國獸醫(yī)科學(xué)，2021. 51（5）： 608-620

[10] Timofie Dorina， Maciuca Iuliana-E.Evans Nicholas-J. et al_ Detection andmolecular characterization of Escherichia coli CTX-M-15 and Klebsiellapneumoniae SHV-12 B -lactamases from bovine mastitis isolates in the U-nited Kingdom. [J]. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2013 （2）：789-94

[11]徐亞珂，產(chǎn)ESBLs大腸桿菌耐藥特征及CfX-M介導(dǎo)的耐藥機(jī)制[D]鄭州大學(xué)．201 8

[12] Nahar Azimun.Awasthi Sharda-Prasad.Hatanaka Noritoshi. et al_Preva-lence and characteristics of extended-spectrum β -lactamase-producing Es-cherichia colimdomestic and imported chicken meats in Japan. [J]. TheJournal of veterinary medical science. 2018 （3）：5 10-5 17

[13]左明開，江西豬源產(chǎn)ESBLs ETEC流行及質(zhì)粒相關(guān)性研究[D]江西農(nóng)業(yè)大學(xué)．2016

[14]楊守深，江妤丹，林敏，等豬源CTX-M型超廣譜p-內(nèi)酰胺酶陽性大腸桿菌耐藥基因的流行性分析[J]中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2021. 43 （5）：552-557

[15]周煒，周芷錦，沈紅霞，等我國豬源和雞源大腸桿菌抗生素耐藥性相關(guān)基因研究進(jìn)展[J]中國獸藥雜志，2021. 55（7）： 59-68

[16]李雪惠，馮濤，閆爽，等貉源大腸桿菌超廣譜p-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）基因型檢測及分析[J]黑龍江畜牧獸醫(yī)，2021 （2）： 66-69