青稞酒曲微生物多樣性分析及低溫耐鹽乳酸菌的分離鑒定

摘要：從不同地區采集6種青稞酒曲，通過高通量測序技術對青稞酒曲中微生物群落結構進行了分析，確定了其中含有的細菌及真菌的豐度及多樣性.對酒曲中的乳酸菌進行分離純化，結合16S rDNA測序分析技術，鑒定出的16株乳酸菌中，有7株為腸膜明串珠菌，6株為戊糖乳桿菌，3株為植物乳桿菌.通過限制性的培養方式對這16株乳酸菌的耐鹽性和耐低溫性進行了測定，結果表明，XZ14、LZ-GB3-2、XZ23、SN-ND8-4、LZ-BY2-2和RKZ-RB2-1這6株乳酸菌具有較好的耐鹽性，在具有較好的耐鹽性的菌株中，RKZ-RB2-1和LZ-BY2-2菌株在22～30 ℃間生長情況較好，這2種菌在低溫發酵食品中具有較好的應用前景.

關鍵詞：青稞酒曲；高通量測序；乳酸菌；耐低溫；耐鹽

中圖分類號：TS261.1文獻標志碼：A

0引言

青稞酒是以青稞為原料，經過精心釀造，自然發酵而成的一種特色飲品［1］.這種發酵飲品不但最大程度地保留了青稞原料的營養成分，而且在酒曲的作用下，青稞酒獲得了獨特的酸甜滋味和濃郁的香氣［2］.青稞酒酒曲中微生物具有多樣性，相關學者經過研究發現，在青稞酒曲中真菌和細菌組成了混合群體，其中，真菌與細菌比例為 28.2∶71.8［3-4］，細菌中乳酸菌是重要組成菌種之一，菌落數可達到5.2×108" lg（CFU/g）［5］，這些菌種都是在相對低溫條件下發酵的，因此青稞酒曲是篩選低溫乳酸菌的可靠原料之一.乳酸菌是一類在食品生產中相當重要的發酵微生物，乳酸菌發酵可產生大量有機酸、醇類和各種氨基酸等代謝物［6］，可抵制腐敗菌，具有改善消化和抗癌等生理作用［7］，目前已經廣泛在食品、藥品和飼料等行業中使用［8-9］.

乳酸菌的發酵溫度一般為35～45 ℃，溫度過低將會導致發酵速度慢，因此具有低溫發酵性能的乳酸菌就成為了發酵產品的亟需菌種.作為調味品，鹽含量相對較高，所以發酵菌種在此類發酵制品中也需要一定的耐鹽性.本研究從不同地區采集來6種青稞酒曲，通過高通量測序探究酒曲中的生物多樣性，再以酒曲為原料，經純化、分離、傳統形態學鑒定和分子生物學鑒定，篩選出耐低溫耐鹽乳酸菌，以期為低溫發酵工藝產品的菌種提供參考.

1材料與方法

1.1儀器

TGL-1650型高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司），THZ-82型恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司），SPX-150B型恒溫培養箱（上海瑯玕實驗設備有限公司），HH-S6型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司），SF-TGL-16M型臺式高速離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司），LDZX-75L型立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），UV-5200型紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司），CX33RTFS2型顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），WP-UPT-20型超純水機（四川沃爾特水處理設備有限公司），PHS-2F型pH計（上海精密科學儀器有限公司），JJ-CJ-1FD型超凈臺（蘇州市金凈凈化設備科技有限公司）.

1.2材料

6種青稞酒曲樣品分別采集于昌都市芒康縣，編號CD-MK；林芝市巴宜區，編號LZ-BY；林芝市工布江達縣，編號LZ-GB；山南市乃東區，編號SN-ND；日喀則市仁布縣，編號RKZ-RB；日喀則市白朗縣，編號RKZ-BL.磷酸二氫鉀、氯化鈉、吐溫-80、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、檸檬酸二銨、無水乙酸鈉、牛肉膏、碳酸鈣，均購自成都市科隆化學品有限公司；酵母粉，購自北京奧博星生物技術有限公司；葡萄糖，購自天津市致遠化學試劑有限公司；瓊脂，購自上海百研生物科技有限公司.

1.3方法

1.3.1不同地區青稞酒曲微生物多樣性分析

將采集的青稞酒曲樣品送至上海生工生物工程股份有限公司進行DNA抽提、PCR擴增和Illumina MiSeq測序.

1.3.2乳酸菌的分離純化及分類鑒定

1）菌株的分離、純化及篩選.先將青稞酒曲在研缽中研成粉末，每種樣品取1 g放入MRS液體培養基中，35 ℃振蕩培養72 h，將培養好的菌液稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8倍，將不同濃度的菌液用涂布器均勻地涂于含碳酸鈣的MRS培養基表面后，于35 ℃的培養箱中培養72 h，然后挑取菌落周圍有明顯的透明圈、長勢較好、菌落表面乳白濕潤、邊緣整齊的有明顯乳酸菌特征的菌落，再使用平板劃線法劃于MRS固體培養基上，于35 ℃培養箱中培養72 h，重復劃線直至分離出單菌.再將單菌編號集中以短線形式劃于MRS固體培養基上，每個單菌劃線3段，再繼續于35 ℃培養箱中培養72 h后，經過革蘭氏染色法染色后的菌株，鏡檢為紫色、桿狀或者小球狀形態，可初步判斷為乳酸桿菌或乳酸球菌［10］，然后將菌種接種于MRS液體培養基中繼續進行傳代培養，同時在MRS斜面培養基中劃線培養，于4 ℃冰箱保存，備用［11］.

2）乳酸菌的分類鑒定.將鏡檢選出的待測菌株在MRS液體培養基中連續培養48 h，使菌株充分活化，保持良好的生命力，收集新鮮的菌體，送至上海生工生物工程股份有限公司進行DNA測序，測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST分析［12］.

3）耐鹽生長測定.將分離出已活化的乳酸菌待測菌株分別接種至50 mL的MRS液體培養基中，30 ℃震蕩培養48 h，將培養液置于50 mL離心管中4 000 r/min離心5 min，用生理鹽水將菌液數調整至OD600值為0.5±0.1，接種至NaCl濃度為5%、7%和9%的MRS液體培養基中培養48 h后，取液體培養基4 000 r/min離心5 min，取上清液于紫外分光光度計測其OD600值［13］.

4）耐低溫生長測定.將選出的耐鹽能力較好的菌株接種于50 mL MRS液體培養基中，30 ℃震蕩培養48 h，將培養液置于50 mL離心管中4 000 r/min離心5 min，用生理鹽水將菌液數調整至OD600值為0.5±0.1，分別接種至MRS液體培養基中后，于22、24、26、28和30 ℃分別培養48 h，將培養液置于50 mL離心管中4 000 r/min離心5 min，取離心液用紫外分光光度計測OD600值［14］.

1.4數據統計與分析

所有樣品重復測定3次，所得結果為平均值±標準差，統計分析和圖表均使用 Excel 2016完成.

2結果與分析

2.1樣品中細菌的分析

2.1.1細菌豐度和多樣性分析

Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性，包括一系列統計學分析指數估計環境群落的物種豐度和多樣性，采用Shannon指數、Simpson指數和Chao1指數對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估［15］.6種酒曲樣品的覆蓋范圍值均大于或等于0.99（見表1），表明樣品序列的覆蓋率高，樣本中序列沒有被測出的概率越低，反映了本次測序結果能代表樣本的真實情況.酒曲CD-MK和酒曲RKZ-RB的Shannon和Chao1指數均小于其余樣品，表明該地區酒曲樣品中細菌豐度和多樣性較低.從圖1可以看出隨著樣品測序量的增加并到達一定值，每個樣品的Shannon曲線已趨于平坦，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU.其中酒曲LZ-GB與酒曲RKZ-BL非常接近，表明兩種樣品中細菌種類均勻度基本一致.

2.1.2細菌微生物群落組成分析

如圖1（A）所示，6種酒曲樣品共檢測出50個細菌屬，其中主要的細菌屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、歐文氏菌屬（Erwinia）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、醋酸菌屬（Acetobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、營發酵單胞菌屬（Dysgonomonas）、埃氏桿菌屬（Escherichia）、葡糖桿菌屬（Gluconobacter）、片球菌屬（Pediococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和未分類菌屬（unclassified）.

從圖1（A）還可以發現，不同樣品中優勢菌在種類及相對分布上有較大的差異.同一地區的樣品間細菌群落組成相似.酒曲LZ-BY和酒曲LZ-GB來自同一市不同縣，酒曲LZ-BY主要以乳球菌屬和未分類菌屬為主，其次是乳桿菌屬、明串珠菌屬和醋酸菌屬；酒曲LZ-GB主要以乳桿菌屬和魏斯氏菌屬為主，其次是歐文氏菌屬、明串珠菌屬和未分類菌屬.酒曲RKZ-BL和酒曲RKZ-RB來自同一市區不同縣，酒曲RKZ-BL主要以明串珠菌屬、魏斯氏菌屬和未分類菌屬為主，其次是腸桿菌屬、葡糖桿菌屬和克雷白氏桿菌屬；酒曲RKZ-RB主要以魏斯氏菌屬和醋酸菌屬為主，其次是明串珠菌屬、乳酸桿菌屬和未分類菌屬.酒曲SN-ND主要以魏斯氏菌屬為主，其次是乳球菌屬和明串珠菌屬.酒曲CD-MK細菌微生物組成較為簡單，主要是乳酸桿菌，與Shannon和Chao1指數反映出細菌群落豐度和多樣性較低的結果一致.

2.1.3細菌微生物群落相似性分析

非度量多維尺度法（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）是一種將多維空間的研究對象簡化到低維空間進行定位、分析和歸類，同時又保留對象間原始關系的數據分析方法，是基于Beta多樣性數值的其中一種圖形展示方式，可反映樣本間菌群結構的差異.由圖1（C）可知，酒曲RKZ-BL和酒曲SN-ND點位于圖右上側，酒曲LZ-BY和酒曲RKZ-RB點位于圖右下側，距離非常接近，表明他們之間的差異很小，樣品間相似度高；酒曲CD-MK和酒曲LZ-GB點位于圖左下側，他們之間距離較遠，差異較大，樣品間相似度低.根據Beta多樣性距離矩陣進行層次聚類分析，可以直觀地反映出多個樣品間的相似性和差異關系.由圖1（D）可知，酒曲RKZ-BL和酒曲SN-ND聚為一類；酒曲LZ-BY和酒曲RKZ-RB聚為一類；酒曲CD-MK與酒曲LZ-GB聚為一類，然而根據NMDS得到的結果可知，這2個樣品之間的相似度較低.

2.2樣品中真菌的分析

2.2.1真菌豐度和多樣性分析

酒曲CD-MK、LZ-BY、LZ-GB、RKZ-BL、RKZ-RB和SN-ND的覆蓋面值均為1（見表2），表明6種樣本序列的覆蓋率高，樣本中序列沒有被測出的概率越低，反映了本次測序結果越能代表樣本的真實情況.酒曲RKZ-RB的Chao1指數最高（268.04），說明該酒曲的真菌微生物豐度最高；酒曲LZ-GB 的Chao1指數最低（179.37），表明該酒曲樣品中真菌群落豐度較低，與其他地區存在一定差異.酒曲CD-MK的Shannon指數最高（1.37），說明該酒曲樣品的真菌群落結構較為復雜；酒曲RKZ-RB的Shannon指數最低（0.61），說明該酒曲真菌群落結構較為簡單.從圖2可以看出隨著樣品測序量的增加并到達一定值，每個樣品的Shannon曲線已趨于平坦，說明測序數據量合理，多數樣本在序列數接近10 000時，OTU已經接近飽和，說明測序量的增加不會導致真菌的多樣性變化.

2.2.2真菌微生物群落組成分析

如圖2（A）所示，6種酒曲樣品共檢測出43個真菌屬，其中主要的真菌屬有酵母菌屬（Saccharomyces）、曲霉菌屬（Aspergillus）、根霉菌屬（Rhizopus）、念珠菌屬（Candida）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、毛霉屬（Mucor）、節擔菌屬（Wallemia）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）和未分類的酵母菌屬（unclassified Saccharomycetales）.

由圖2（A）還可以發現，不同樣品中優勢菌在種類和相對分布上沒有較大的差異.除了酒曲CD-MK樣品真菌是以未分類的酵母菌屬和念珠菌屬為優勢菌株，其他酒曲均以未分類的酵母菌屬和根霉菌屬為優勢菌株.酒曲CD-MK樣品菌株種類相對于其他酒曲樣品較為豐富，其次是酒曲LZ-GB.

2.2.3真菌微生物群落相似性分析

通過點與點間的距離反映不同樣品間的差異程度.由圖2（C）可知，酒曲RKZ-RB、酒曲RKZ-BL和酒曲LZ-GB距離非常接近，表明他們之間的差異很??；酒曲LZ-BY、酒曲CD-MK和酒曲SN-ND各自之間的距離且與酒曲RKZ-RB（酒曲RKZ-BL和酒曲LZ-GB）較遠，差異較大.根據Beta多樣性距離矩陣進行層次聚類分析，可以直觀地反映出多個樣品間的相似性和差異關系.由圖2（D）可知，酒曲分為2大支，其中1支是酒曲SN-ND，另1支酒曲CD-MK，酒曲CD-MK與酒曲RKZ-RB（酒曲RKZ-BL、酒曲LZ-BY和酒曲LZ-GB）又可分為2類，所以酒曲LZ-BY與酒曲LZ-GB之間相似性較高，酒曲SN-ND與各樣品相似度低，差異性大，是相對獨立的群落.

2.3乳酸菌的分離及分類鑒定結果分析

2.3.1乳酸菌的純化與分離

從青稞酒曲樣品涂布的平板上挑取到具有乳酸菌形態的菌落（見圖3（A）），經反復分離與純化得到37株菌株，部分進行活化用于生理生化鑒定，另一部分保存待用.

2.3.2菌株的形態特征

對分離出的37株菌株進行革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察，觀察到菌株染色為紫色呈革蘭氏陽性，且形態為短桿狀或球狀（見圖3（B）），則初步認定其為乳酸桿菌或乳酸球菌，統計結果見表3.共計16株，編號分別為RKZ-BL6-1、RKZ-RB2-1、LZ-BY1-1、SN-ND3-1、SN-ND8-4、RKZ-BL1-1、RKZ-RB3-3、RKZ-RB11-1、LZ-GB2-1、LZ-BY2-1、XZ14、XZ34、XZ23、LP、LZ-GB3-2和LZ-BY2-2.傳統形態學鑒定法雖然操作簡單、成本低，但是對乳酸菌鑒定做出的判斷準確度不高，目前在實驗室鑒定乳酸菌常用首選的方法是分子生物學鑒定中的16S rDNA/rRNA鑒定法，可大大提高鑒定的準確性.

2.3.3分子生物學鑒定結果

將所測乳酸菌菌株進行DNA提取和PCR擴增（見圖4），用所得的堿基序列與數據庫中的堿基序列相對比，發現測序的菌株中RKZ-BL6-1、RKZ-RB2-1、RKZ-RB3-3、RKZ-RB11-1、LZ-BY1-1、SN-ND3-1和SN-ND8-4菌株，共計7株為腸膜明串珠菌，RKZ-BL1-1、LZ-GB2-1、LZ-GB3-2、LZ-BY2-1、LZ-BY2-2、XZ14、XZ34、XZ23和LP菌株，共計9株為植物乳桿菌或戊糖乳桿菌，由于植物乳桿菌與戊糖乳桿菌的DNA序列十分相似，所以難以用基因鑒定的方法來區分他們，需要根據這2種乳酸菌糖代謝的差異來進行區分，根據《伯杰細菌鑒定手冊》可知，植物乳桿菌與戊糖乳桿菌對D-木糖的代謝有明顯差異，前者無法利用D-木糖而后者可以利用.

經16S rDNA基因序列分析鑒定，將16株分離純化得到的乳酸菌鑒定至種，確定7株菌株為腸膜明串珠菌，6株菌株為戊糖乳桿菌，3株菌株為植物乳桿菌，具體結果見表4.

2.3.4耐鹽生長測試結果

將篩選出的16株乳酸菌分別接種至NaCl濃度為5%、7%和9%的MRS液體培養基中，30 ℃培養48 h后，測定其在600 nm處的吸光度，通過此方式研究其對不同NaCl濃度的耐受能力，16株乳酸菌耐鹽生長測試結果如圖5所示.

由圖5可知，隨著培養基中NaCl濃度不斷升高，16株菌株的OD600值在逐漸減小，因此根據不同濃度下菌株的耐鹽能力，篩選得到6株耐鹽性能較好的乳酸菌，分別是菌株XZ14、LZ-GB3-2、XZ23、SN-ND8-4、LZ-BY2-2和RKZ-RB2-1.

2.3.5乳酸菌低溫生長測試結果

將耐鹽生長測試中篩選出的XZ14、LZ-GB3-2、XZ23、SN-ND8-4、LZ-BY2-2和RKZ-RB2-1共6株耐鹽性能較好的乳酸菌接種至MRS液體培養基中，分別在22～30 ℃之間培養48 h，其OD600吸光度如圖6所示.

由圖6可知，6株乳酸菌在低于24 ℃時生長較為緩慢，隨著溫度的升高，特別是在24～28 ℃間，菌株生長變得活躍，在溫度超過28 ℃后菌株的生長速度趨于緩慢，其中RKZ-RB2-1和LZ-BY2-2菌株在22～30 ℃間較其余4株菌株生長良好.因此，根據不同溫度下菌株的耐低溫能力，篩選得到2株耐低溫性能較好的乳酸菌，分別是菌株RKZ-RB2-1和LZ-BY2-2.

3結論

通過高通量測序分析6種不同青稞酒曲的群落結構和物種多樣性之間的差異，從6種青稞酒曲中共檢出50個細菌屬和43個真菌屬.細菌屬主要有乳桿菌屬、乳球菌屬、歐文氏菌屬、明串珠菌屬、醋酸菌屬和魏斯氏菌屬等，真菌屬主要有酵母菌屬、曲霉菌屬、根霉菌屬、念珠菌屬、生絲畢赤酵母屬、復膜孢酵母屬、毛霉屬、節擔菌屬和威克漢姆酵母屬等.由此可見，乳酸菌也是在青稞酒發酵過程中有關鍵作用的微生物之一，是重要的風味功能微生物.

通過純化分離、鏡檢及基因檢測，從青稞酒曲中分離出RKZ-BL6-1、RKZ-RB2-1、RKZ-RB3-3、RKZ-RB11-1、LZ-BY1-1、SN-ND3-1和SN-ND8-4共7株腸膜明串珠菌，RKZ-BL1-1、LZ-GB2-1、LZ-BY2-1、XZ34、XZ23和LP共6株戊糖乳桿菌，以及LZ-GB3-2、LZ-BY2-2和XZ14共3株植物乳桿菌.通過耐鹽與低溫生長測試，篩選出LZ-BY2-2和RKZ-RB2-1共2株耐鹽與耐低溫性能較好的乳酸菌，在NaCl濃度5%～7%、生長溫度26～28 ℃間生長較為活躍，NaCl濃度高于7%，生長溫度高于28 ℃對菌株的生長有抑制作用.

綜上，采集的6種酒曲中篩選出了2株耐鹽與耐低溫性能較好的乳酸菌LZ-BY2-2和RKZ-RB2-1，篩選出的優良菌種可為后續低溫發酵試驗提供科學依據，也可為低溫發酵工藝產品可持續發展提供保證.

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（責任編輯：伍利華）

Analysis of Microbial Diversity and Isolation of Low

Temperature and Salt Tolerant Lactic Acid

Bacteria from Highland Barley Koji

MENG Fanbing1，FU Zhengxu1，LI Yuncheng1，YUAN Ye2，MA Changzhong3（1.School of Food and Biological Engineering，Chengdu University，Chengdu 610106，China;

2.Zunyi Bozhou District Market Supervision Administration，Zunyi 563099，China;

3.College of Food Science，Tibet Agriculture and Animal Husbandry University，Linzhi 860000，China）Abstract：Six kinds of highland barley koji were collected from different regions in Tibet.The microbial community structure in highland barley koji was analyzed by high-throughput sequencing technology，and"the abundance and diversity of bacteria and fungi were determined.The lactic acid bacteria （LAB） in highland barley koji were isolated and purified，and the 16S rDNA sequencing analysis technology was used to identify 16 LAB strains，including 7 of Leuconostoc intestinalis，6 of Lactobacillus pentosus and 3 of Lactobacillus plantarum.The low temperature tolerance and salt tolerance of these 16 strains were tested by a restrictive culture method.The results show that the six LAB strains XZ14、LZ-GB3-2、XZ23、SN-ND8-4、LZ-BY2-2 and RKZ-RB2-1 have good salt tolerance，and the 6 strains have good salt tolerance.Among the strains，the strains RKZ-RB2-1 and LZ-BY2-2 grow better at 22～30℃.These two strains have good application prospects in low temperature food fermentation.

Key words：highland barley koji;high-throughput sequencing;lactic acid bacteria;low temperature tolerance;salt tolerance