枯草芽孢桿菌對魚類氣單胞菌的拮抗作用

閆子豪 , 劉 洋 , 李月紅,2

(1. 吉林農業大學動物科學技術學院 ， 吉林 長春 130118 ； 2. 動物生產及產品質量安全省部共建教育部重點實驗室 ， 吉林 長春 130118)

益生菌可以改善宿主體內的生態環境，減少疾病的發生，近年來成為水生動物飼喂抗生素最有潛力的替代品。枯草芽孢桿菌作為益生菌中的一大類，具有改善水體的生態環境、抑制有害菌的生長、維持和調整腸道微生態平衡、提高飼料利用率、促進動物生長、緩解重金屬對魚體腸道的影響[1]等優良特性;可以形成芽孢，在極端惡劣的條件下生存，細胞壁中不含內毒素，可以分解明膠，還原硝酸鹽，水解淀粉，是水產養殖中經常使用的微生態制劑[2]。微生態制劑進入腸道后可以通過生物拮抗和爭奪氧氣含量抑制有害微生物的生長，拮抗作用是微生物之間普遍存在的自然現象，微生物可以通過分泌抗生素、有機酸等拮抗物質來抑制其他微生物生長。枯草芽孢桿菌能顯著提高吉富羅非魚幼體的免疫功能、抗氧化力和攻毒存活率，減少生產上的用藥，有利于構建無公害養殖模式。

氣單胞菌嗜溫型(運動性)包括維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、舒伯特氣單胞菌和溫和氣單胞菌等。還有一類是嗜冷型(非運動性)氣單胞菌[4]。氣單胞菌是魚類運動性氣單胞菌敗血癥(MAS)的主要病原體，發病特征表現為身體充血和腹部膨脹。氣單胞菌主要存在于淡水魚類中，偶爾也存在于海洋魚類中。其他水生動物，包括對蝦、螃蟹、貽貝、鰻魚和青蛙也易感，至今已經發現維氏氣單胞菌的多種毒力基因，如外毒素(又稱腸毒素)、氣溶素、外膜蛋白、彈性蛋白酶、金屬蛋白酶、各種黏附因子等[5]。氣單胞菌對我國的水產養殖業的威脅越來越大，更重要的是，氣單胞菌通過水和水生食物從環境傳播給人類，導致近年來人類感染增加，包括急性腹瀉以及皮膚和軟組織感染。目前，氣單胞菌作為食源性致病菌越來越受到重視[6]。

1 氣單胞菌

1.1 氣單胞菌的致病機理 以嗜水氣單胞菌為例，它可以產生多種毒力因子。氣溶素(Aerolysin)是嗜水氣單胞菌的主要毒性蛋白，可以通過在細胞膜表面形成孔洞造成溶血[7]。彈性蛋白酶(Elastase)是嗜水氣單胞菌產生的一種熱穩定的金屬蛋白酶，該蛋白酶可以水解彈性蛋白和酪蛋白，有研究證明，彈性蛋白酶可以造成鰻魚和小鼠死亡[8]。金屬蛋白酶(Metalloprotease)是一類活性依賴于金屬離子的蛋白酶，可以幫助細菌入侵宿主和幫助細菌在宿主體內繁殖，并且造成實驗動物死亡[9]。Suarez等[10]報道了嗜水氣單胞菌SSU的6型分泌系統(T6SS)在小鼠模型中發揮了重要的毒力作用，溶血共調節蛋白(Hcp)能夠被運到細胞質內，通過Caspase 3途徑誘導細胞凋亡，幫助細菌逃避宿主的天然免疫，來讓細菌在宿主細胞內更好地繁殖。

1.2 氣單胞菌的危害 研究表明[11],由維氏氣單胞菌分泌的氣溶素破壞了斑馬魚的腸道屏障，促使維氏氣單胞菌本身和其他氣單胞菌進入到魚的體內導致魚死亡。我國華南地區血病暴發的主要原因是維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的聯合感染，并且維氏氣單胞菌是疾病暴發的先決條件。近年來，在我國發現的由于感染維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌而引發疾病的發病率呈現上升趨勢，并且因為抗生素的使用，使得這些菌株耐藥性和毒力也變強。Uzun等[12]在對市場購置的水產品和肉產品中分離的87株菌進行鑒定，發現維氏氣單胞菌占有60%。龔倩等[13]發現，吉林某養殖場中框鏡鯉細菌疾病暴發的致病菌為維氏氣單胞菌。鄧院生等[14]研究發現，蘇州地區大部分鯽魚出血死亡是由維氏氣單胞菌導致的。Ran等[15]在2018年進行的研究顯示，2009—2014年我國南方各省的鯉魚敗血癥暴發是由維氏氣單胞菌而非嗜水氣單胞菌引起的。

2 枯草芽孢桿菌

2.1 枯草芽孢桿菌的作用機理 在水生生物中，枯草芽孢桿菌主要有2種行為方式，競爭排斥和免疫調節，通過刺激機體免疫應答，增強細胞免疫誘導動物自身免疫反應，提高自身免疫力。加入水體或者通過魚類排便進入水體后，枯草芽孢桿菌可以去除水體中的氨氮、亞硝酸鹽和沉降金屬，凈化水質，增加水體溶氧量，能有效地改良養殖水體，提高水生動物的整體健康水平，從而減少養殖水體污染導致的魚類疾病和死亡[6]。枯草芽孢桿菌通常在消化道和腸道黏膜上定植，使病原菌不能黏附在腸道中，從而減少病原菌。有些益生菌通過產生有機酸，改變腸道內環境的pH，產生一些廣泛的拮抗物質和抗生素化合物，抑制病原菌和其他細菌的生長。通過產生各種化合物激活動物的免疫系統，從而提高對病毒、細菌、真菌和寄生蟲的抵抗能力[11]。枯草芽孢桿菌具有廣譜抗菌和抗生物膜活性[16]。

2.2 枯草芽孢桿菌對氣單胞菌的拮抗作用

2.2.1 體外拮抗 沈智華等[17]的研究發現，枯草芽孢桿菌對河蟹氣單胞菌致病菌和魚類細菌性敗血癥病原菌有抑制作用，但對甲魚致病性氣單胞菌無明顯抑制作用。有研究表明，枯草芽孢桿菌對溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌都具有一定的抑制作用。但對于嗜水氣單胞菌只有在枯草芽孢桿菌初始接種濃度高于嗜水氣單胞菌的初始接種濃度時才能發揮抑制作用，對于不同病原菌引發的水產養殖動物疾病要挑選不同的治療方案[18]。楊麗莉等[19]的研究表明，枯草芽孢桿菌產生的抗菌脂肽可以增加嗜水氣單胞菌的細胞膜通透性，造成細菌滲透壓失衡和胞內物質泄漏，最終引起細菌死亡。任雨薇[20]通過共同培養枯草芽孢菌和嗜水氣單胞菌，發現枯草芽孢桿菌可以抑制嗜水氣單胞菌的多個毒力基因的表達，包括氣溶素aer、彈性蛋白酶ahyB、溶血共調解蛋白hcp、金屬蛋白酶emp以及其他群體感應luxS基因表達;此外，還證明當luxS表達下降，嗜水氣單胞菌的毒力因子表達也下降，可能是由于枯草芽孢桿菌產生了某種化合物能夠干擾嗜水氣單胞菌的群體感應系統。在王娜[21]的研究中，把嗜水氣單胞菌J-1的luxS基因敲除，結果顯示該菌的毒力基因aer、ahe、emp和hcp等表達量也出現了下降的現象。體外的拮抗作用是枯草芽孢桿菌的首選篩選方式，不同來源、不同群落的枯草芽孢桿菌對氣單胞菌的拮抗效果也不同。

2.2.2 體內拮抗 早在1986年Kozasa[22]首次將益生菌用于水產養殖中，因其降低了愛德華氏菌引起的日本鰻鱺魚苗死亡，此后益生菌特別是芽孢桿菌受到了水生生物學家們的注意，在水生動物上的研究和應用得到了迅速發展。Kong等[23]研究了口服芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌引起的草魚腸道黏膜屏障功能損害和炎癥的影響，結果表明，枯草芽孢桿菌可以保護腸道絨毛的完整性和緊密的連接結構，減少嗜水氣單胞菌誘導的腸黏膜屏障功能損壞和炎癥。Tang等[24]通過在飼料中添加枯草芽孢桿菌并測定嗜水氣單胞菌對草魚的氧化應激損傷，結果表明，枯草芽孢桿菌可以為魚類提供有效的保護，使魚體免受嗜水氣單胞菌感染引起的氧化應激損害。Hao等[25]在草魚日糧中添加了枯草芽孢桿菌，然后對草魚腸道中的菌群進行16S rDNA基因序列比較，結果證明枯草芽孢桿菌可以積極改善草魚腸道內微生物群落的組成，這與調節草魚的免疫力有關，可能會降低草魚養殖期間疾病暴發的風險。Banerjee等[26]評估了從魚胃腸道分離的枯草芽孢桿菌LR1的益生菌潛力，包括拮抗活性、酶產生、溶血活性、生物安全性、抗生素敏感性和膽汁耐受水平，結果顯示LR1對分歧桿菌和鮭魚氣單胞菌等致病菌的活性有抑制作用，并且可以有效降低印度主要鯉魚的細菌致病性。Newaj等[27]的研究也證明了通過飼喂從魚腸獲得的枯草芽孢桿菌可以有效控制魚致病性氣單胞菌感染。還有研究使用富含枯草芽孢桿菌的鹵蟲飼喂觀賞魚(瑪麗魚)，結果表明在枯草芽孢桿菌飼養鹵蟲濃度為1×105CFU/mL條件下可以改善腸道菌群和對嗜水氣單胞菌的抗性[28]。展勝[29]通過對鯽魚飼喂含有B.velezensisC-11和S-22的魚糧2周，空腹1 d后進行維氏氣單胞菌攻毒試驗，通過對照腸道絨毛發現飼喂枯草芽孢桿菌的腸道絨毛基本完好無損，同時其可刺激鯽魚機體免疫，提高鯽魚的抗病力。大量的試驗都證明了枯草芽孢桿菌在漁業發展中的諸多益處，如改善水體生態環境，提高魚體免疫力，對致病菌的拮抗作用等，其能很大程度的提高魚類存活率，提升魚類生長效率，增加經濟效益。

3 展望

枯草芽孢桿菌具有改善水質、增加宿主的生長、改善腸道菌群、對病原菌的拮抗等優良特性，使其作為益生菌在眾多農業領域中得到廣泛應用。近年來，越來越多的研究者選擇了枯草芽孢桿菌作為生物制劑，但是對于枯草芽孢桿菌的研究還需要進行更加細致和深入的研究，包括對病原菌拮抗作用的機制，枯草芽孢桿菌在魚腸道的定植機理，是否與其他益生菌或藥物產生拮抗作用進而對腸道菌群有消極的影響，對于不同生長階段魚類的作用效率以及枯草芽孢桿菌的產品開發及應用問題等，同時對于枯草芽孢桿菌群體感應系統的研究也具有巨大的潛力。