粗寡核苷酸的純化方法現(xiàn)狀及進(jìn)展

陶 煒

（美亞藥業(yè)海安有限公司，江蘇南通 226601）

寡核苷酸是一種20～30個堿基左右的短鏈核苷酸，可以用于DNA 測序、PCR 擴(kuò)增、基因檢測、反義核苷酸研究等領(lǐng)域。以寡核苷酸為基礎(chǔ)的反義技術(shù)是迄今為止實現(xiàn)抑制或消除遺傳信息的最常見和最成功的方法[1]。合成寡核苷酸序列的反義效應(yīng)在20世紀(jì)70年代末首次被Zamecnik 和Stephenson 證明。扎米尼克和斯蒂芬森利用勞斯肉瘤病毒（RSV）35S RNA 的5'端和3'端核苷酸序列，確定了21個重復(fù)序列，這些重復(fù)序列對病毒整合至關(guān)重要。他們合成了一個13堿基的寡核苷酸（AATGGTAAAATGG）是該病毒序列的一部分。將合成的寡核苷酸序列導(dǎo)入感染RSV的成纖維細(xì)胞中，可顯著抑制病毒的產(chǎn)生。他們正確地得出結(jié)論，寡核苷酸通過與關(guān)鍵序列雜交并阻斷它們來抑制病毒整合并用雜交來描述這種寡核苷酸。

1 寡核苷酸概述

1.1 寡核苷酸的概念

寡核苷酸通常是由20個以內(nèi)短鏈核苷酸（脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸）組成，是短RNA 或DNA低聚體，簡單地說，就是數(shù)量較少的幾個堿基聚合在一起的核苷酸。寡核苷酸具有多種引物長度，可采用預(yù)設(shè)計、定制或隨機(jī)形式，在微陣列、凝膠遷移分析、人工基因合成、PCR、DNA 測序、分子克隆、法醫(yī)學(xué)和其他研究中應(yīng)用。當(dāng)前研究寡核苷酸種類很多，包括藥物，例如反義寡核苷酸、小干擾核糖核酸、微小核糖核酸、核酸適配體等。寡核苷酸可以通過Watson-Crick 堿基互補(bǔ)配對原理與DNA、mRNA或者pre-mRNA 配對而實現(xiàn)非常高的選擇性，精準(zhǔn)地抑制某些基因，讓編碼異常的基因保持“沉默”，從而阻止許多“錯誤”的蛋白質(zhì)表達(dá)。寡核苷酸既可以自然形成也可以人工合成。

1.2 寡核苷酸的物化性質(zhì)

影響寡核苷酸理化性質(zhì)的因素主要是寡核苷酸的化學(xué)修飾。寡核苷酸的化學(xué)修飾主要是5'端和3'端核苷酸序列。寡核苷酸與DNA 或RNA 發(fā)生雙鏈作用時，能夠進(jìn)行非互補(bǔ)鏈的置換，達(dá)到抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的目的。另外，寡核苷酸還能夠合成DNA，用于鏈聚合反應(yīng)，將DNA 的片段放大。在聚合反應(yīng)的過程中，將DNA 中發(fā)生標(biāo)記的片段與用于核酸擴(kuò)增的化學(xué)修飾的寡核苷酸引物結(jié)合，形成DNA 的復(fù)制品。

1.3 寡核苷酸的應(yīng)用

寡核苷酸可用于藥物探索和開發(fā)中、用于診斷測試中、用作研究劑（諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）中的引物或探針）、用作靶標(biāo)驗證中的反義劑、用作轉(zhuǎn)錄因子的競爭性抑制劑、用作核酶、用作適體、用作免疫系統(tǒng)的刺激物或用作治療疾病的生物治療劑[2]。具體用途如下：

（1）寡核苷酸引物和探針

合成寡核苷酸最普遍的用途是在各種應(yīng)用中用作相對較短的探針和引物（最多30個聚體）。這涉及合成與較大的靶DNA 或RNA 鏈（靶序列）成對或“反向互補(bǔ)”的核苷酸序列。作為引物，寡核苷酸通常用于引發(fā)酶促反應(yīng)（例如：寡糖），以生成短或長靶序列的數(shù)百萬至數(shù)十億個副本，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）或Sanger 測序方法。寡核苷酸引物的應(yīng)用包括DNA測序、基因表達(dá)、克隆和分子診斷。

作為探針，寡核苷酸用于鑒定以及結(jié)合特定的DNA 或RNA 靶序列，以確認(rèn)該序列在特定材料中的存在。使用寡核苷酸探針的應(yīng)用包括印跡程序，例如Northern 印跡（用于RNA）或Southern 印跡（用于DNA），作為微陣列中的熒光團(tuán)偶聯(lián)序列，可檢測基因表達(dá)的變化，或者用于篩選遺傳疾病或鑒定特定病原體（分子診斷）。

（2）寡核苷酸治療/基因治療

在治療應(yīng)用中，反義寡核苷酸（ASO）（通常為20～30個聚體物種）利用自然生物學(xué)促進(jìn)對不良或過度活躍RNA 序列的基因抑制或基因沉默（破壞），從而阻止對有可能造成或誘發(fā)疾病的某些受損或過度活躍蛋白質(zhì)的表達(dá)。關(guān)于基于寡核苷酸療法的研究已經(jīng)明顯加強(qiáng)，近年來已經(jīng)批準(zhǔn)了多種藥物。

1.4 寡核苷酸的合成

寡核苷酸的合成方法有固相技術(shù)法、亞磷酸三酯法，合成步驟如下[3]：

第一步：脫保護(hù)基。利用三氯乙酸有機(jī)溶劑，將雙核苷酸的DMT 保護(hù)基團(tuán)脫去，從而得到游離狀態(tài)的5′-羥基端，以便于進(jìn)行后續(xù)的縮合反應(yīng)。

第二步：活化。為了得到3′-端被活化、受DMT 保護(hù)的5′-端的有活性的中間體亞磷酰胺四唑，將四氮唑活化劑與核苷酸單體保護(hù)物質(zhì)亞磷酰胺進(jìn)行混合，然后加入到合成柱內(nèi)，目的是保證中間體亞磷酰胺四唑能夠與脫保護(hù)基的核苷酸發(fā)生縮合反應(yīng)。

第三步：連接。當(dāng)進(jìn)行縮合反應(yīng)時，一旦中間體亞磷酰胺四唑保持活性，則與脫保護(hù)基的核苷酸游離狀態(tài)的5′-羥基端發(fā)生親和反應(yīng)，使亞磷酰胺四唑的四唑脫去，同時又增加了一個堿基在寡核苷酸鏈上。

第四步：封閉。為了避免未發(fā)生親和反應(yīng)的5′-羥基端發(fā)生后續(xù)反應(yīng)連接在寡核苷酸鏈上，利用乙酰化手段將該5′-羥基端封閉。

第五步：氧化。核苷酸單體在發(fā)生縮合反應(yīng)時，利用亞磷酯鍵，完成寡核苷酸的連接，但是由于亞磷酯鍵化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，容易發(fā)生酸堿分解反應(yīng)，為了得到穩(wěn)定的寡核苷酸，避免亞磷酯鍵被分解，通常選擇碘的四氫呋喃溶液。

2 粗寡核苷酸的純化方法現(xiàn)狀

寡核苷酸可以化學(xué)合成以用于研究和醫(yī)學(xué)目的的短DNA 或RNA 寡聚體。寡核苷酸通常通過以下方式制備：逐步添加核苷酸殘基以產(chǎn)生特定序列。在合成過程中，任何步驟的低效都是可能的，導(dǎo)致寡聚體缺失核苷（“N-1雜質(zhì)”）或具有磷酸二酯鍵而不是所需的硫代磷酸酯鍵（“P=O 雜質(zhì)”）。另外，在合成期間或之后暴露于氧化條件可以將P=S 鍵轉(zhuǎn)化為P=O鍵以形成P=O 雜質(zhì)。完成所需序列的寡核苷酸的合成后，目標(biāo)寡核苷酸被作為與所有失敗的序列和N-1雜質(zhì)和P=O 雜質(zhì)的混合物獲得。然后需要將這些雜質(zhì)與目標(biāo)寡核苷酸分離。目前寡核苷酸的純化方法大致可以分為兩種：

（1）寡核苷酸合成過程中的影響因素是寡核苷酸質(zhì)量和長度，因此，為了確保寡核苷酸能夠正常合成，需要在合成過程中控制寡核苷酸的質(zhì)量以及長度。以寡核苷酸分離方法為基礎(chǔ)研究可知，現(xiàn)有寡核苷酸質(zhì)量和長度的控制方法包括聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術(shù)和高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，都是基于不同長度的寡核苷酸在介質(zhì)中移動的速度差異分離出目標(biāo)寡核苷酸。這兩個方法的通量都不高。

①聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)是一種高效的純化引物和分析合成過程的方法。聚丙烯酰胺凝膠電脈分離的依據(jù)是分子在電場中的遷移率不同和丙烯酰胺膠的分子篩效應(yīng)。分離寡核甘酸一般用變性膠，較好地排除了分子形狀對遷移率的影響，因此遷移率主要決定于分子的質(zhì)量和電荷之間的比值，在一定的pH 下，此值與寡核甘酸分子量的常用對數(shù)成正比。該方法分離精度高，相差一個堿基的寡核甘酸分子也能得到很好的分離。電泳分離之后直接用紫外照射，以硅膠熒光板為背景，可以清楚地顯現(xiàn)條帶。此純化方法無長度等限制，所得產(chǎn)品可以滿足最苛刻的分子生物學(xué)實驗要求。此外通過電泳顯帶，還能分析合成的過程，以代替分步收集DMT 陽離子進(jìn)行分析的傳統(tǒng)方法。PAGE 純化的缺點是費時、費人力，勞動強(qiáng)度也較高。此方法為絕大多數(shù)分子生物學(xué)實驗者所采用。

②高效液相色譜（HPLC）技術(shù)。高效液相色譜法是當(dāng)前分離純化寡核苷酸的主要方法，分離純化的指標(biāo)是目標(biāo)物和雜質(zhì)的分離度，現(xiàn)有高效液相色譜法方法中使用TEAB 作為離子對試劑，對寡核苷酸進(jìn)行分離純化，該方法又稱反相離子對色譜法。由于TEAB 的保留性能一般，所以目標(biāo)物與雜質(zhì)之間的分離度較差。寡核苷酸不能得到真正有效的分離，對于一些缺少一個堿基的片段的雜質(zhì)，經(jīng)常會和目標(biāo)物共流出，從而影響純度導(dǎo)致下游應(yīng)用效果變差。

（2）基于DMT 基團(tuán)的特異性吸附，目標(biāo)寡核苷酸在合成最后一個堿基后可以選擇性地帶有DMT 基團(tuán)，而提前中止的寡核苷酸不帶這個基團(tuán)，這種差異可以被特異性結(jié)合DMT 基團(tuán)的介質(zhì)識別，從而只收獲目標(biāo)寡核苷酸。這個方法通量較高，但只適合于較短的寡核苷酸，而且在純化后還需要加一步去除DMT 基團(tuán)的操作。如果合成的寡核苷酸質(zhì)量很高，也可以直接脫鹽純化，即只去除非DNA 的雜質(zhì)，不會對下游操作產(chǎn)生太大的影響。

①OPC 柱純化。OPC 柱純化是專為合成引物的純化而設(shè)計的純化小柱，利用柱料和合成的引物5′-端DMT 的親和力來特異吸附含DMT 的寡核甘酸分子，因此在合成后的后續(xù)處理時，應(yīng)注意不要脫掉DMT，在純化的過程中再脫此基團(tuán)。從合成過程可以知道，只有合成的寡核甘酸鏈的最后一個堿基，即5′-末端上有DMT 基團(tuán)，所以該方法可以高效的去掉鹽分、短片段，純化后的產(chǎn)物可達(dá)到較高的純度，可用于大多數(shù)的分子生物學(xué)實驗。該方法高速（15～20min）、高效，可實現(xiàn)自動化。但該方法受長度限制，當(dāng)需要純化的寡核甘酸鏈長度超60bp 時，需要作特殊的處理；其次，受柱容量的限制，只能純化10～20OD 粗產(chǎn)物，純化后1～5OD。另外，當(dāng)實驗對oligo 的純度要求較高時，很難達(dá)到要求。

②脫鹽純化。化學(xué)合成寡核苷酸目前多采用高通量合成儀合成，合成每批次一般有96或384個。脫鹽純化是利用C18柱的強(qiáng)疏水作用對寡核苷酸進(jìn)行特異性吸附，利用有機(jī)溶液達(dá)到洗脫目的，實現(xiàn)分離純化。根據(jù)各種分子極性的不同從而達(dá)到分離效果，能有效地去掉鹽分，不能去除短片段，是一種快速、簡便的脫鹽方法。脫鹽后的寡核甘酸可用作普通的PCR 的引物、雜交探針等用途，不適合作為測序引物，也不適用于克隆表達(dá)等進(jìn)一步用途的PCR 的引物。

以上幾種方法都是基于物理或化學(xué)的方法來分離目標(biāo)寡核苷酸，在通量和分離效率上都有一定的局限。生物酶通常具有高效、專一的特點，核酸酶是其中專門水解核酸的蛋白質(zhì)的總稱，根據(jù)其作用底物的不同，存在不同的分類。RNA 酶和DNA 酶分別作用于RNA 和DNA；雙鏈核酸酶和單鏈核酸酶分別作用于雙鏈核酸和單鏈核酸；內(nèi)切酶作用于核酸序列的內(nèi)部，而外切酶則作用于核酸序列的兩端。其中外切酶根據(jù)其作用方向的不同，又可分為5’-3’外切酶和3’-5’外切酶。

3 粗寡核苷酸的純化方法進(jìn)展

合成核苷酸的未來用途是了解DNA 和RNA 疫苗的形式。盡管不是嚴(yán)格意義上的寡核苷酸，但是長度為數(shù)百或數(shù)千個堿基的基于DNA 或RNA 的疫苗產(chǎn)品（如mRNA 或質(zhì)粒或基于載體的核酸）代表著不斷發(fā)展的合成核苷酸技術(shù)的前沿。從概念上講，DNA 或RNA 疫苗將免除病原細(xì)菌或病毒的所有不必要或有害部分。相反，這種基于核酸的疫苗將僅包含病原體DNA 或RNA 少數(shù)部分的代碼。這些DNA 或RNA 鏈將指導(dǎo)患者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生單個抗原或病原體片段。通過現(xiàn)代化運(yùn)算和計算機(jī)模擬，只要存在設(shè)計時參考的適當(dāng)靶序列，便可以在數(shù)日或數(shù)周內(nèi)創(chuàng)建這些寡核苷酸疫苗形式。作為一種平臺技術(shù)，基于核酸的疫苗依賴于成套標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)件或原材料，可隨心所欲地實現(xiàn)多種組合。因此與傳統(tǒng)疫苗形式相比，它們相對便宜且易于生產(chǎn)。

然而，對于生物制藥行業(yè)而言，這仍然是一種正在成熟的范式，并且正在不斷解決新的挑戰(zhàn)，其中一些挑戰(zhàn)是寡核苷酸和長核酸產(chǎn)物所獨有的，而一些挑戰(zhàn)則與其他生物治療形式共有。寡核苷酸的純化及表征是目前制藥行業(yè)的一大熱點。然而，寡核苷酸的表征，特別是通過離子對反相液相色譜（IP-RPLC）進(jìn)行表征，則非常具有挑戰(zhàn)性。隨著寡核苷酸的純化方法的發(fā)展以及新用途，研究了寡核苷酸純化方法包括反相高效液相色譜（RP-HPLC）或具有基于二氧化硅或聚合物顆粒的固定相的離子交換色譜技術(shù)。

1）反相高效液相色譜。對于RP-HPLC 純化方法，5'-O-三苯甲基保護(hù)基通常用于在合成過程中保護(hù)合成寡核苷酸的5'-羥基，然后用于從不具有5'-O-三苯甲基保護(hù)基的較短的失效序列（“三苯甲基ON”序列）純化全長寡核苷酸序列）（“三苯甲基ON”序列）。然而，這樣的方法需要額外的步驟以在純化后除去三苯甲基保護(hù)基，這增加了整個純化的成本和時間。大規(guī)模RP-HPLC 純化過程也可能是昂貴的，因為大量使用有機(jī)溶劑和需要高度專用的設(shè)備來處理高壓需求。

2）離子交換色譜技術(shù)。離子交換色譜技術(shù)常用于純化天然和合成的寡核苷酸。用于離子交換色譜技術(shù)的放大純化比RP-HPLC 方法成本低得多，并且壓力要求低得多。已經(jīng)在分析和制備規(guī)模上使用離子交換層析成功地分離了寡核苷酸。然而，可形成四鏈體二級結(jié)構(gòu)的富含鳥嘌呤的寡核苷酸由于其龐大的尺寸和電荷，可在陰離子交換固定相上表現(xiàn)出廣泛的保留，并且在一些情況下與陰離子交換固定相不可逆地結(jié)合，從而使得通過陰離子交換色譜法純化這些富含鳥嘌呤的寡核苷酸變得困難或不可能。

4 結(jié)語

隨著全球寡核苷酸治療藥物市場的增長，使用適當(dāng)?shù)氖侄螌押塑账徇M(jìn)行純化和放大是必不可少的。通過對寡核苷酸的性質(zhì)和應(yīng)用了解與概括，研究討論了有關(guān)寡核苷酸純化方法現(xiàn)狀和存在的問題，并提出解決方案，旨在滿足市場的復(fù)雜需求，促進(jìn)寡核苷酸合成行業(yè)的發(fā)展。