超聲輔助-分散液液微萃取結(jié)合超高效液相色譜
——串聯(lián)質(zhì)譜分析馬尿中痕量氨魯米特

陳 茜，馬智超

（武漢商學(xué)院馬科學(xué)研究及馬匹違禁物品檢測中心，湖北武漢 430056）

芳香酶是生物體內(nèi)催化雄激素前體轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵限速酶，而芳香酶抑制劑可以特異性地降低芳香酶的活性，抑制雄性激素的芳構(gòu)化，從而有效阻斷雌二醇的合成，降低生物體內(nèi)雌激素水平，引發(fā)性類固醇負(fù)反饋，促使下丘腦促性腺激素釋放激素和黃體生成素分泌增加，從而刺激睪酮的生物合成和分泌[1]。因此，在賽馬運動中，濫用芳香酶抑制劑被認(rèn)為是間接服用雄激素的一種手段。國際馬術(shù)聯(lián)合會（Federation Equestre Internationale，F(xiàn)EI）公布的《2019國際馬聯(lián)興奮劑禁用清單》中明確規(guī)定芳香酶抑制劑作為激素與代謝調(diào)節(jié)中的一類，屬于賽內(nèi)外均禁用的物質(zhì)[2]。氨魯米特（Aminoglutethimide）是第一代非甾體類芳香酶抑制劑，其代謝途徑主要以50%的原型隨尿排出，因此氨魯米特在馬術(shù)興奮劑檢測中以尿檢為主。在WADA的技術(shù)文件中規(guī)定，芳香化酶抑制劑類藥物的最低檢測能力要求（MRPL）為20ng/mL，但是對于陽性樣品的判定未設(shè)定下限，這代表對檢測靈敏度的要求越來越高[3]。

國內(nèi)外研究小組已相繼報道過多種檢測氨魯米特的方法，Mareck等開發(fā)了GC/MS法對尿液中氨魯米特進(jìn)行鑒定的方法[4]，Kang等用LC-MS/MS法對包括氨魯米特在內(nèi)的抗雌激素物質(zhì)進(jìn)行興奮劑篩查[5]，然而上述方法對尿液的前處理方法一般采用酶解后提取的方法，由于尿液組成復(fù)雜、基質(zhì)干擾大，傳統(tǒng)的富集方法會存在耗時長、富集效率低、響應(yīng)靈敏度低、有機溶劑消耗大等缺點。近年來Lai等合成了分子印跡納米微球進(jìn)行固相萃取富集人尿中的氨魯米特并結(jié)合HPLC法進(jìn)行測定[6]，選擇性和靈敏度有所提高，但過程較為煩瑣，成本高，易交叉污染。

分散液液微萃取（DLLME）是一種操作方便、設(shè)備簡單、價格經(jīng)濟(jì)、節(jié)約時間、環(huán)境友好且具有高富集率的前處理方法，自2006年Rezaee提出以來，已廣泛應(yīng)用于食品分析、農(nóng)藥殘留分析、藥物分析、毒品分析等領(lǐng)域[7-9]。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，未見報道采用DLLME前處理方法從馬尿樣本中提取和檢測氨魯米特的研究。因此，本文旨在建立一種超聲輔助分散液液微萃取結(jié)合超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UA-DLLME-UPLC-MS/MS）方法，用于痕量測定馬尿中的氨魯米特，為國內(nèi)馬術(shù)運動檢測氨魯米特提供高靈敏檢測方法。

1 實驗部分

1.1 試劑

氨魯米特標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Selleck公司；甲喹酮標(biāo)準(zhǔn)品購自上海Anpel公司；乙腈，甲醇，甲酸（LCMS級）均購自美國Themo公司；異丙醇，四氫呋喃（HPLC級）均購自上海Macklin公司；四氯乙烯、氯苯、鄰二氯苯，四氯化碳，溴乙烷，溴苯（分析純）均購自上海Macklin公司；二氯甲烷，二硫化碳（分析純）均購自上海Aladdin公司；空白尿樣來自武漢商學(xué)院國際馬術(shù)學(xué)院的無藥物濫用史的實驗馬。

1.2 儀器

TSQ Altis Plus三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Themo Fisher Scientific公司）；超純水機（美國Millipore公司）；臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，5810R）；超微量天平（德國Sartorius公司）；pH計（德國Sartorius公司，PB-30L）；漩渦混勻器（德國IKA公司，Vortex 3）；超聲清洗儀（中國昆山舒美公司，KQ-100 VDV）；金屬浴氮吹儀（武漢恒信世紀(jì)科技有限公司）。

1.3 色譜條件

色 譜 柱 ：Thermo Hypersil Gold C18柱（2.1mm×100mm×3mm）；流動相：A相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸水，B相為乙腈；梯度洗脫程序：0 ~ 2.0min，保持5%B；2.0~6.0min，從5%B變?yōu)?5%B，6.0~8.0min，保持95%B，8.0~8.1min，從95%B變?yōu)?%B，8.1~10.0min，保持5%B；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：5.0μL；時間：10min；柱溫：30 ℃。

1.4 質(zhì)譜條件

多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）；離子化方式：電噴霧（ESI）；離子極性：正離子模式；正離子掃描，噴霧電壓3 500V；鞘氣：30Arb；輔助氣體：10Arb；離子傳輸管溫度：350 ℃；霧化溫度：400 ℃；氨魯米特的定量離子對、定性離子對、碰撞能量分別為233.00/188.04（m/z）、233.00/146.00（m/z）、14.86/20.96（eV），甲喹酮的定量離子對、定性離子對、碰撞能量分別為251.10/91.08（m/z）、251.10/132.03（m/z）、35.58/26.82（eV）。氨魯米特和甲喹酮的保留時間分別為4.30、6.20min。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液和陽性尿的制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取氨魯米特標(biāo)準(zhǔn)品1.0g（精確至0.0001g），加入10.0mL乙腈配制成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于-80℃下儲存，再依次按比例稀釋成100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?zhǔn)確量取1.0mL甲喹酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1.0mg/mL），加入10.0mL甲醇配制成0.1mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備溶液，于-80℃下儲存，再依次按比例稀釋成100ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

陽性尿：取定量氨魯米特標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入空白尿樣，配制一系列濃度的陽性尿用于DLLME的優(yōu)化和方法驗證。

1.6 樣品預(yù)處理

精確吸取3mL陽性尿于15mL尖底離心管中，加入50μL甲喹酮內(nèi)標(biāo)工作溶液，用約150μL 1mol/L氨水溶液調(diào)節(jié)pH至10.5，將400μL鄰二氯苯和500μL四氫呋喃的混合物用1mL胰島素注射器快速注入樣品溶液，在整個樣品中分散形成了非常細(xì)小的液滴，然后使用超聲頻率80Hz超聲處理1min形成均勻的乳濁液體系，接著在4 000r/min下4℃離心10min，上層用移液槍除去水相并棄去，下層沉淀相在40 ℃的水浴下氮吹近干，用1mL流動相（乙腈-0.1%甲酸，5∶95，體積分?jǐn)?shù)）復(fù)溶。最后，用0.22μm尼龍濾膜過濾上述溶液，用于UPLC-MS/MS上樣分析。

2 結(jié)果與討論

為獲得較高的萃取回收率，需進(jìn)行各項因素的優(yōu)化實驗，包括萃取劑和分散劑的種類、體積比，樣品的pH、離子強度、超聲時間和超聲頻率。在本次優(yōu)化過程中，馬尿樣品固定為3mL，氨魯米特和內(nèi)標(biāo)甲喹酮的濃度固定為5ng/mL。無特殊說明，所有數(shù)據(jù)點做三次平行實驗。

2.1 萃取劑與分散劑的選擇

選擇合適的萃取劑-分散劑組合是提高萃取效率的關(guān)鍵，因此本實驗選用二氯甲烷、四氯化碳、四氯乙烯、氯苯、鄰二氯苯、溴乙烷、溴苯和二硫化碳作為萃取劑，甲醇、乙腈、異丙醇、四氫呋喃作為分散劑，進(jìn)行樣本提取回收率的考察，以選取最佳組合。結(jié)果顯示，當(dāng)分散劑為四氫呋喃時，相比分散劑，回收率普遍較高，其中氯苯和鄰二氯苯的平均回收率分別為96.2%和97.7%，綜合考慮選擇萃取劑-分散劑組合為鄰二氯苯-四氫呋喃。

2.2 萃取劑與分散劑體積比的確定

為找到最佳萃取劑與分散劑體積比，固定分散劑的體積為500mL，依次增加萃取劑的體積，控制兩者之間的比例為1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5、6∶5、7∶5、8∶5、9∶5、10∶5，考察它們對氨魯米特回收率的影響，發(fā)現(xiàn)回收率隨萃取劑體積的增加而提高，當(dāng)萃取劑與分散劑的體積比達(dá)到4∶5時，回收率最高，隨后回收率值保持較高水平。考慮到節(jié)省試劑和氮吹濃縮的時間，最終選擇萃取劑與分散劑體積比為4∶5進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實驗。

2.3 pH影響

氨魯米特的pKa為11.6，因此，應(yīng)將樣品調(diào)整到堿性狀態(tài)，這樣可降低氨魯米特在水中的溶解度。為確定最佳pH，使用1mol/L氨水調(diào)整樣品溶液的pH至 5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5。 隨 著pH的增加，萃取率增加，直至pH為10.5時萃取率最高。當(dāng) pH >10.5時，pH的萃取率降低，因為當(dāng)pH為4.0時，氨魯米特更多處于分子狀態(tài)，有利于向有機相轉(zhuǎn)移，增大萃取率。因此，選擇pH為10.5進(jìn)行下一步的優(yōu)化。

2.4 鹽的影響

為了研究鹽添加的影響，本實驗按0、5%、10%、15%、20%比例添加NaCl來考察萃取效果。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl用量的增多，離心后得到的沉淀相體積有著明顯的降低，這說明鹽的添加提高了萃取劑在水溶液中的溶解度。萃取后得到的回收率數(shù)據(jù)也證明了這點，隨著NaCl添加量的增加，萃取率持續(xù)降低。因此，后續(xù)實驗中不添加鹽。

2.5 超聲時間及頻率的影響

本實驗考察了0~5min時間萃取率的變化，萃取率在1min達(dá)到最大，隨著時間的增加，萃取率逐漸降低，這可能是因為長時間超聲會造成超聲儀器內(nèi)以及萃取容器內(nèi)的溫度升高，加速萃取溶劑的揮發(fā)，損失部分待分析物。因此，選擇超聲時間為1min作為最優(yōu)條件。

進(jìn)一步考察了三種不同超聲頻率45Hz、80Hz、100Hz對3個平行馬尿樣品中氨魯米特的提取效果，結(jié)果表明，超聲頻率對萃取率基本無影響，但80Hz下RSD最低。因此，考慮到萃取過程的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，超聲頻率選擇80Hz。

2.6 方法驗證

用初始流動相將氨魯米特工作溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，甲喹酮內(nèi)標(biāo)濃度均為5ng/mL，然后按照上述優(yōu)化后的前處理步驟進(jìn)行處理并進(jìn)行UHPLC-MS/MS測定，每種濃度做三次平行實驗，取平均值。得出的數(shù)據(jù)以氨魯米特與內(nèi)標(biāo)甲喹酮的進(jìn)樣濃度比x為橫坐標(biāo)，氨魯米特與甲喹酮定量離子的積分面積比y進(jìn)行線性擬合，求得線性回歸方程為y=0.03345x-0.00271，r=0.9994，線性范圍是0.1 ~50ng/mL，證明氨魯米特的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。檢出限（LOD）和定量限（LOQ）采用向空白尿樣中逐級降低加標(biāo)濃度的方法來確定，分別以3倍和10倍信噪比（S/N）對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為LOD和LOQ，分別為0.05ng/mL和0.1ng/mL。

選擇日內(nèi)和日間精密度來衡量方法的精密度，用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來表示，測試選用5ng/mL氨魯米特進(jìn)行，測得結(jié)果日內(nèi)精密度RSD為2.1，日間精密度RSD為4.3，證明該方法精確度良好。為了評估方法的重復(fù)性，六個平行加標(biāo)濃度為5ng/mL的尿液經(jīng)過上述優(yōu)化后的前處理，用UHPLC-MS/MS法測得RSD為5.8，證明該方法的重復(fù)性良好。

為考察前處理過程的萃取效率，配制低（1ng/mL）、中（5ng/mL）、高（10ng/mL）三種濃度的加標(biāo)尿樣，進(jìn)行優(yōu)化后的UA-DLLME-UHPLC-MS/MS法測得數(shù)據(jù)，每種濃度做六次平行實驗。結(jié)果表明，氨魯米特的回收率在81.4% ~ 113.2%，RSD < 5.6%，證明該前處理方法可以有效提取馬尿中的氨魯米特。

為考察方法的選擇性，配制20份空白尿樣，按照優(yōu)化后的前處理方法上樣測定，未發(fā)現(xiàn)假陽性結(jié)果，證明該方法的選擇性良好。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)評估

由于尿液基質(zhì)復(fù)雜，會影響測定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。為考察基質(zhì)的檢測結(jié)果，本實驗采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算基質(zhì)效應(yīng)，公式為：

基質(zhì)效應(yīng)（ME）=（SA-SB）/SB×100%

式中：SA是指基質(zhì)溶液加標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，SB是指超純水溶液加標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

結(jié)果算得基質(zhì)效應(yīng)為-4.9%，|ME|小于20%，表現(xiàn)出弱基質(zhì)效應(yīng)，基本可忽略不計。可見采用分散液液微萃取前處理方法，可以有效改善馬術(shù)興奮劑檢測中基質(zhì)效應(yīng)的干擾。

2.8 方法比較

與其他測定尿樣中氨魯米特的檢測方法（文獻(xiàn)5、文獻(xiàn)6）相比，UA-UPLC-MS/MS方法具有明顯的優(yōu)勢：萃取時間短、線性范圍寬、檢出限低，能滿足馬術(shù)運動興奮劑檢測要求中的快速、靈敏度高。

3 結(jié)束語

本研究利用檢測中心現(xiàn)有的儀器設(shè)備，建立了超聲輔助分散液液微萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定FEI禁用物質(zhì)氨魯米特的定量方法并進(jìn)行了方法驗證。與傳統(tǒng)溶劑提取方法相比，整個實驗過程無須酶解，減少了有機溶劑的用量，縮短了檢測周期，降低了檢測成本。實驗結(jié)果表明，本方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，無基質(zhì)效應(yīng)干擾，完全滿足馬術(shù)運動興奮劑檢測的要求。