發酵乳制品風味物質種類、形成途徑以及提取和檢測方法的研究進展

牧其爾，徐偉良，李春冬，王福超，陶曉臣，郭 梁*

（1.錫林郭勒職業學院 草畜系，內蒙古 錫林浩特 026000；2.錫林郭勒生物工程研究院，內蒙古 錫林浩特 026000；3.錫林郭勒盟畜牧工作站，內蒙古 錫林浩特 026000）

發酵乳制品是原料乳在特定微生物的作用下，通過乳酸菌單純發酵或乳酸菌和酵母菌共同配合發酵制成的具有特殊風味物質的酸性乳制品。其中以牛乳為原料的發酵乳制品最為常見。牛乳含有豐富的人體所需營養物質，通過多種微生物的協同發酵，將乳糖、蛋白質、脂肪等營養物質分解產生多味肽、氨基酸、脂肪酸等多種風味營養成分，不僅保留了鮮牛乳的乳香味，而且增添了特殊發酵風味[1-2]。研究表明，發酵乳制品具有抗氧化[3]、降低膽固醇[4]、抗腫瘤[5]、免疫增強[6]及抗變異原[3，7]等醫療保健功能。

風味是食品重要的組成部分，風味產品深受消費者喜愛和購買[8]。對于消費者，食品的不同風味可以滿足不同人群客戶；對于生產者，食品的風味與經濟效益密切相關。因此國內外對于食品風味的研究是食品研究的熱點之一。近年來，國內外對于發酵乳制品風味物質的研究較多。李娟等[9]運用氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ionmobility spectrometry，GC-IMS）對多種乳制品進行風味物質檢測，共檢測出29種揮發性風味化合物；JIA W等[10]運用高效液相色譜-高分辨率四級軌道質譜聯用技術基于外標法檢測山羊奶樣品中的風味物質種類，并且發現了獨特的風味化合物；CAPOZZI V等[11]運用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）和質子轉移反應-飛行時間質譜（proton transfer reaction-time of flight mass spectroscopy，PTR-TOF-MS）兩種技術對不同商品馬斯卡泊尼干酪頂空中的揮發性有機化合物進行了分析，鑒定出27種不同化學類別的揮發性有機化合物。然而，對于發酵乳制品中風味物質的研究還不夠系統，目前，針對發酵乳制品的研究主要集中在發酵劑的選擇[12]、菌種的分離篩選以及發酵性能等方面[13-15]。本文以研究發酵乳制品與風味物質之間的關系為出發點，對發酵乳制品風味物質的分類、形成途徑、提取和檢測方法進行了論述，以期對發酵乳制品風味物質的進一步研究提供參考。

1 發酵乳制品主要風味物質的分類

發酵乳制品中雖然存在多種風味物質，但由于各種物質的含量不盡相同，只有濃度超過閾值的物質才能影響其風味[8，16]。風味物質的多少能夠直接影響發酵乳制品口感及香味，研究發現，發酵乳制品中風味物質成分的分子質量＜400 Da，風味閾值在0.001～1 000 μg/L[17]。發酵乳制品中主要風味物質為酸類、醇類、酯類、羰基化合物、芳香族以及其他化合物等[18-19]。

酸類主要分為揮發性酸和非揮發性酸。揮發性化合物主要影響發酵乳制品的香味，大部分揮發性有機化合物都來源于原乳，主要包括乙酸、丙酸、丁酸為主的C2～C10的飽和脂肪酸。乳酸是影響發酵乳制品風味的最具有代表性的非揮發性酸，可以作為檢測發酵程度的指標。乳酸主要給人一種爽口的風味，是一種天然的防腐劑。除此之外，影響發酵乳制品風味的非揮發性酸有檸檬酸、草酸、丙酮酸等。

醇類中的乙醇是發酵乳制品中最重要的醇類風味物質，是微生物分解葡萄糖和氨基酸的最終產物。此外，還有其他醇類影響發酵乳制品的風味，如3-甲基丁醇是乳酸乳球菌通過發酵產生麥芽香味的主要成分[20]。

酯類一般在水果中含量較多，產生方式主要以脂肪酸代謝為主。由于酯類化合物自身帶有果香味，能將脂肪酸和胺的苦味有效降低[21]。分子質量較小的酯類化合物（乙酸乙酯、乙酸甲酯）對發酵乳制品風味的影響較大，酯類化合物的含量隨著儲存時間的延長而增加[22]。

羰基化合物主要有三種：雙乙酰、乙醛和乙偶姻，其中雙乙酰是產生奶油香氣的主要來源。雙乙酰的穩定性較弱，易在還原酶的作用下被還原成乙偶姻，乙偶姻也具有奶油香氣，但香氣遠不如雙乙酰（大約是乙偶姻的100倍）[23]。

芳香族類化合物以及其他化合物是發酵乳制品芳香味的主要來源，主要有苯甲醛、甲苯和乙苯等化合物。除此之外，其他影響發酵乳制品風味的化合物還有吡嗪、呋喃等雜環類化合物、酮類以及某些脂肪、乳糖、氨基酸或蛋白質通過熱降解產生的化合物等。吡嗪與芳香族化合物一樣，具有芳香味，是加熱食品焙烤味和堅果味的香味成分[24]。酮類化合物能賦予發酵乳制品不同風味，如2-戊酮具有水果味，壬酮具有土腥味，3-羥基-2-丁酮具有黃油味。

2 發酵乳制品中風味物質形成的途徑

發酵乳制品中風味物質形成的途徑主要有3種：原料乳、加工過程和微生物的代謝途徑。

2.1 原料乳成分對風味物質形成的影響

原料乳是影響發酵乳制品風味成分的因素之一，目前已經檢測到油酸、丙酮、游離脂肪酸和乙醛是構成原料乳奶香味主要成分，而這些化合物同樣也是影響發酵乳制品風味的化合物，除了這些還有少量的二甲硫醚，研究表明，二甲硫醚風味閾值在12 μg/mL，超出閾值會直接影響原料乳的奶香味[25]。奶牛飼養條件、自身的因素以及季節等因素也會對原料乳的風味物質產生影響。如飼料中的一些風味物質直接通過血液進入乳腺從而影響其風味[26]。HEDEGAARD R V等[27]研究三種飼養條件下的原料乳脂肪酸，結果表明，飼養條件不同，其脂肪酸的氧化程度不同。綜合而言，原料乳是發酵乳制品風味物質的主要來源之一。

2.2 加工過程對風味物質形成的影響

原料乳的加工（標準化生產、殺菌、均質）會引起風味物質含量的變化，主要有三個途徑。第一，在高溫殺菌過程中原料乳中含硫物質，如二甲基硫化物、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物和二甲基砜等會隨著加熱濃度會增加，從而影響其風味[28]。第二，在加熱過程中，會產生美拉德反應。美拉德反應是食品中常見的化學反應，會產生吡嗪、呋喃、含N、S、O的雜環化合物等多種反應產物，從而影響發酵乳制品風味[29-30]。第三，原料乳中脂肪經過熱分解，形成游離態脂肪酸，脂肪酸經過脫羧、還原、水解等一些列反應后生成酯類、酸類、羰基化合物等影響風味的物質，最終影響發酵乳制品風味[25]。

2.3 微生物的代謝對風味物質形成的影響

微生物的代謝會直接影響發酵乳制品的風味。目前，用于發酵乳制品的微生物有乳酸和香味物質產生菌、乳酸產生菌以及檸檬酸發酵的香味產生菌3種[25，31]。在發酵過程中所選擇的微生物種類會直接影響發酵乳制品風味物質的含量。發酵乳制品能否產生獨特的風味取決于微生物是否在糖酵解、檸檬酸代謝、氨基酸代謝中起重要作用。

2.3.1 乳糖的糖酵解

乳糖糖酵解是發酵乳制品風味物質來源的重要途徑之一。發酵過程中，大部分乳糖隨乳清排出，只有少量（10%）的乳糖在乳酸菌的作用下進行發酵。在糖酵解過程中，發酵乳制品的氧化還原電位和pH會降低，緩慢進行酶促反應，產生許多影響發酵乳制品風味的化合物，主要有雙乙酰、乙醛、乙醇和乙偶姻等。乳糖在β-半乳糖苷酶的作用下轉化為葡萄糖，葡萄糖通過糖酵解產生丙酮酸。丙酮酸在丙酮酸脫氫酶或者在丙酮酸甲酸裂解酶的作用下產生中間產物乙酰輔酶A（乙酰-CoA），乙酰輔酶A通過醛脫氫酶生成乙醛。丙酮酸還能直接在丙酮酸脫羧酶或者在丙酮酸氧化酶的作用下直接生成乙醛[20]。除此之外，乙醛還可以通過利用核苷酸或者氨基酸通過丙酮酸直接轉化生成[8，32]。

2.3.2 檸檬酸的代謝

原乳中檸檬酸的含量很低，主要是通過乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰突變株、腸膜明串珠菌乳脂亞種以及腸膜明串珠菌葡聚糖亞種進行發酵產生[33]。檸檬酸的代謝和乳糖糖酵解有著密切聯系，檸檬酸首先裂解成草酰乙酸，草酰乙酸直接轉化為α-乙酰乳酸，進而通過氧化脫羧生成雙乙酰以及乙偶姻。草酰乙酸還能通過乙酰脫羧生成糖酵解的中間產物丙酮酸，最終生成雙乙酰和乙偶姻。此外，檸檬酸通過代謝，還能產生其他的風味物質，如丙酸和乙酸等。

2.3.3 氨基酸的代謝

酪蛋白是產生風味物質重要的前體物質之一。乳酸菌的蛋白酶水解系統可將乳制品中酪蛋白降解為氨基酸，這些氨基酸能轉化為風味化合物，特別是其中的支鏈氨基酸、芳香族氨基酸和硫酸氨基酸這3種氨基酸是主要的風味物質來源[34-35]。根據對乳酸乳球菌和嗜溫菌氨基酸分解代謝的相關研究中發現，氨基酸分解代謝會受到α-酮酸的限制，但含有谷氨酸脫氫酶的菌株能從谷氨酸產生α-酮戊二酸，增強氨基酸的分解代謝，從而產生更多的風味物質[36]。

3 提取和檢測風味物質的方法

3.1 提取風味物質的方法

溶劑萃取法是化學領域中最為常見的一種提取物質的方法，利用食品中風味物質在不同溶劑中的溶解性差異來達到分離提取目的。溶劑萃取法具有操作簡便、回收率和選擇性高等優點在食品領域廣泛使用，AVSAR Y K等[37]采用溶劑萃取法（真空條件）分析切達干酪中的風味物質，檢測出50多種芳香族化合物；YAHYA F等[38]將正己烷作為溶劑提取香蘭葉中2-乙酰基-1-二氫吡咯，發現隨著浸泡時間的延長，提取效率會提高。

頂空捕集法分為3種：固相微萃取法、靜態頂空捕集法和動態頂空捕集法。目前國內外關于采用頂空捕集法檢測食品風味的研究較多，成堃等[39]采用SPME-GC-MS法分析原味酸奶、藍莓汁以及藍莓味酸奶（發酵時間為5 h、8 h）中揮發性風味物質，發現酮類化合物的含量會隨著發酵時間的延長而提高。羅天淇等[40]利用SPME-GC-MS法和香氣活力值（odour active value，OAV），檢測宮廷奶酪揮發性風味物質及其含量，發現36種揮發性風味物質，其中辛醛的OAV含量最高。

蒸餾提取法是一種提取食品中揮發性化合物的最有效方法，在一定溫度下，根據蒸氣壓不同來分離液體混合物中各組分的揮發性化合物[41]。常用的蒸餾提取法有水蒸氣蒸餾法（steam distillation，SD）和同時蒸餾萃取法（simultaneous distillation extraction，SDE）。SD法主要用于制備分離熱不穩定樣品，而SDE法主要在氣相色譜前處理時分離揮發性成分的應用上。CARPINO S等[42]用SD法從干酪中提取了揮發性風味化合物，然后對其進行了詳細的分析；艾對等[43]使用SDE法從羊奶粉提取揮發性風味化合物，經氣相色譜-質譜聯用儀分析，共檢測出了22種化合物。

超臨界流體萃取法（supercritical fluid extraction，SFE）根據不同物質在超臨界液體中具有不同的溶解度或同一物質在不同壓力和溫度下的溶解度存在差異，從而按照物質自身性質（分子量大小、沸點高低、極性大小）選擇性的將物質依次分離出來[44]。SFE法具有高效率、操作簡便、用時短等優點，廣泛用于多個領域，例如環境、食品、生物、藥物和無機物等[45-46]。

3.2 檢測風味物質的方法

在食品風味物質的研究當中，分析鑒定所分離出來的具體物質組成需要借助氣相色譜法、紅外光譜法、紫外光譜法、質譜法、核磁共振波譜法、高效液相色譜法、電子鼻/電子舌、代謝組學技術、蛋白質快速檢測儀和蛋白質組學技術等現代分析技術進行鑒定分析[44，47]。

紅外光譜法和紫外光譜法具有快速、高效率及對樣品無損害等優點，可用于發酵乳制品的快速檢測。孫雷[48]利用偏最小二乘法和BP神經網絡建立預測酸乳中脂肪和蛋白質含量的模型，采用近紅外光譜檢測樣品中的脂肪和蛋白質含量。質譜法和核磁共振波譜法是化學領域常規的檢測方法，主要通過樣品的質譜圖和核磁共振譜圖確定化合物。

高效液相色譜法可根據化合物的相對分子質量、生物分子間親和力以及離子交換能力對化合物進行分離檢測，可檢測沸點高、穩定性差的化合物。目前，高效液相色譜法主要用于檢測發酵乳制品蛋白質和糖類。

電子鼻和電子舌技術是根據模仿生物嗅覺和味覺來檢測分析、識別物質的新穎技術，具有檢測速度快、對環境依賴性小、效率高、操作簡便以及樣品無需前期處理等優點，目前已經應用于多種食品領域（茶葉、飲料、乳制品、肉類、酒類），評價食品的新鮮度、摻假以及對加工過程進行監測。HANSEN T等[49]研究6個金屬氧化物傳感器組成的電子鼻與GC-MS相結合，檢測豬肉加工過程中的揮發性成分，檢測了肉品的質量。CHIKUNI K等[50]用電子舌技術研究肌肉纖維類型在牛肉味覺特征中的作用，表明不同部位的肌肉纖維的鐵含量、脂肪酸含量有所不同，影響其口感。

代謝組學技術是一種新穎的檢測方法，與傳統的檢測方法相比，代謝組學技術可通過基因組學和蛋白組學對發酵乳制品的口感、風味和營養成分進行分析，探究代謝產物含量與目標物含量之間的關系，最終研究整個代謝途徑。SETTACHAIMONGKON S等[51]聯合采用幾種檢測方法（核磁共振波譜法、氣相色譜法、頂空固相微萃取法）研究酸乳中的代謝風味物質，進而探究影響酸乳品質和發酵過程的因素。LU Y等[52]利用一維和二維核磁共振波譜法快速、直接地對酸奶發酵過程產生的全部化合物進行代謝組學技術分析，實現非靶向代謝產物的檢測。蛋白質快速檢測儀目前主要用于工業生產的乳制品蛋白質的檢測，可對大量樣品進行快速檢測，具有高的精密度和準確度。蛋白質組學技術是指在特定時間對特定生物系統中的蛋白質進行大規模分析技術，研究蛋白質的結構和功能、豐度的定量、修飾狀態、蛋白質之間的相互作用[53]。陳笛[54]采用蛋白質組學技術對不同加熱條件下的羊乳蛋白質進行分析，探究不同加工條件對發酵乳品質的影響。研究發現，聯合使用兩種或以上的分析法，可以提高檢測效率，其中最常用的方法為氣相色譜質譜法（GC-MS），能一次性對混合物進行定性和定量分析。馬艷麗等[55]采用SPME-GC-MS技術從奶豆腐、奶疙瘩、乳餅、乳扇以及切達奶酪中檢測出脂肪酸類、芳香類和醇類化合物等多種揮發性風味物質；張玥琪等[56]利用GC-MS方法在研究藍波奶酪的風味物質研究中，共鑒定出111種揮發性風味物質成分。GC-MS法應用范圍廣，不僅在食品分析方面[57-58]發揮著重要的作用，而且在藥物分析、環境監測方面也有所應用[59-60]。

4 結語

近年來，關于發酵乳制品的研究大部分集中在生產工藝方面，而對于發酵乳制品中風味物質的研究還不夠系統，尤其是風味物質的形成機理是否與初始原乳組份有關，以及微生物發酵過程中化合物之間的相互轉化機理還有待進一步科學探究。此外，發酵乳制品加工過程中原乳、生產工藝、發酵劑等因素，也會直接影響其風味，對其最終產品風味的影響也需要進行深入考慮。隨著科技的不斷發展，風味物質的檢測技術也在不斷完善與提高，可以從原料選擇、發酵生產和加工儲藏等多個方面入手，不斷對一些新型風味成分和風味物質的形成作用機制進行挖掘，可更加系統的研究發酵乳制品的風味物質，以期改善發酵產品風味，研發新型風味產品，最終促進乳制品產業化發展。