乳酸菌細菌素抑菌特性及在食品中的應用研究進展

杜 琨

（武警工程大學 裝備管理與保障學院，陜西 西安 710086）

乳酸菌細菌素是乳酸菌代謝過程中產生的一類具有抗菌活性的小分子肽類物質，大多是以30～60個氨基酸組成的小分子形式存在。多數產細菌素的乳酸菌是從酸奶、泡菜、酸菜等中分離得到，可被人體內蛋白酶降解，對腸道微生物群不會產生太大影響，被公認為安全級（generally recognized as safe，GRAS），因而常被用作食品防腐劑[1-4]。

乳酸菌素可以抑制或殺滅許多致病菌和腐敗菌[5-7]，包括金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單核細胞增生利斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）、肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridium botulinum）等[8]。但其抑制或殺滅的菌大多數為革蘭氏陽性菌，少數乳酸菌產生的乳酸菌素能抑制革蘭氏陰性菌的生長[9]。到目前為止已發現7種不同屬的乳酸菌可產生抑菌活性物質[10-11]。近年來，人們對乳酸菌素進行了深入研究，有大量關于天然乳酸菌細菌素特征的詳細報道，但只有少數被證明在生物醫學和食品領域有用，如乳鏈球菌素（Lacticin）和乳酸鏈球菌素（Nisin）[12-13]。

研究表明，乳酸菌細菌素具有以下特點[14]：①乳酸菌細菌素是蛋白類或肽類物質，由核糖體合成，進入人體后被迅速分解，不影響腸道菌群；②大部分乳酸菌細菌素對熱穩定，溶于水，不受紫外線等的影響；③乳酸菌細菌素對親緣較近的種屬有抑制作用，殺菌方式呈現不可逆，對人體無害；④產細菌素的菌株自身具有免疫力。

1 乳酸菌細菌素的分類

根據乳酸菌細菌素的化學結構、作用方式、相對分子質量、抗菌譜、熱穩定性和輸出機制等，將乳酸菌細菌素分為三類，I類羊毛硫細菌素、II類細菌素、Ⅲ類細菌素及Ⅳ類細菌素，II類細菌素進一步可分為IIa、IIb、IIc和IId 4個亞類[15]。

第I類乳酸菌細菌素為羊毛硫細菌素（Lantibiotics），分子質量＜5 kDa，由19～50個氨基酸分子組成[16]，分子內含有羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸、賴氨酸丙氨酸、2,3-雙脫氫丙氨酸、（Z）-2,3-雙脫氫丁氨酸、β-羥基天冬氨酸、S-（2-氨基乙烯基）-D-半胱氨酸等非編碼氨基酸，對熱穩定、對革蘭氏陽性菌有較寬抗菌譜（葡萄球菌、鏈球菌、李斯特菌屬、桿菌和腸球菌）。

第II類乳酸菌細菌素不含羊毛硫氨酸、對熱穩定[17]，分子質量＜10 kDa。包括IIa、IIb、IIc和IId 4個亞類，其中IIa類細菌素是II類細菌素中主要的亞種，抗菌譜相比Ⅰ類細菌素較窄，其中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）產生的乳酸片球菌素為主要代表；IIb類細菌素是由兩種不同的肽分子組成的多肽，當每種肽的肽比率相等時才會發揮協同作用，產生最佳抗微生物活性；Ⅱc類細菌素的分子主鏈具有頭－尾環化的結構特征；Ⅱd類細菌素包括非單線性肽，依賴于sec分泌途徑的細菌素以及具有N-末端前導序列，并在翻譯后立即有活性的無前導序列細菌素。

第Ⅲ類乳酸菌細菌素為熱敏感大分子蛋白，分子質量＞30 kDa，以維生素J為主要代表，此外還包括lysostaphin，enterolysin A，helveticin J等細菌素。

第Ⅳ類乳酸菌細菌素為大分子復合細菌素，其活性成分含有蛋白質、類脂、碳水化合物等，包括Lactocin 27，Plantaricin S等細菌素。

根據乳酸菌細菌素產生菌的種屬不同，將細菌素分為六類[18-19]：①乳球菌屬細菌素，有乳酸鏈球菌素（Nisin）、雙球菌素（Diplococcin）、乳鏈菌素（Lacticin）、乳球菌素（Lactococcin）。②片球菌屬細菌素，有PA-1、AcH以及啤酒片球菌（P.cerevesiae）FBB63和乳酸片球菌（P.acidilactici）PC產生的未命名的細菌素。③明串珠菌屬（Leuconostoc）細菌素，有Leucocin A、Carnocin、Mesenterocin。④肉食桿菌屬（Carnobacteriocin）細菌素，有Carnocin U149、Carnobacteriocin A1、Carnobacteriocin A2、Carnobacteriocin A3、Carnobacteriocin B1、Carnobacteriocin B2。⑤乳桿菌屬（Lactobacillus）細菌素，有Sakaein A、Sakaein M、Sakacin P、Plantaricin A、Plantaricin B、Plantaricin C、Plantariein ST、Plantariein BN、laCtocin S、Curvaein A、Breviein、Helveniiein J、Helventiein V-1829、Lactocin 27、Caseiein80、Bavaein MN、Fennenticin Lactocin F、Lactocin B等近20種。⑥腸球菌屬產細菌素，有7C5、EnterocinA、Enterocin B等。

2 乳酸菌細菌素的研究現狀

2.1 國外研究現狀

在菌株篩選方面，TROPCHEVA R等[20]從保加利亞傳統發酵乳中分離出具有抑菌功能的短乳桿菌（Lactobacillus brevis）；MATEI A等[21]從腌菜中篩選出抑制黃曲霉和黑曲霉毒素的乳酸菌株。

在應用方面，LYNCH K M等[22]將淀粉乳桿菌用于切達干酪，可延長霉菌變質時間；AHLBERG S H等[23]將分離的乳酸菌應用于飼料中黃曲霉毒素的抑制，效果良好。

2.2 國內研究現狀

我國于20世紀80年代開始對乳酸菌細菌素進行研究，1988年中科院微生物研究所開始對Nisin進行研究，并對產Nisin的菌株進行分離研究，1992年中試成功后，開始了對Nisin的商業化生產。目前，國內乳酸菌細菌素的研究主要包括Nisin的作用機制、影響Nisin活力的因素、遺傳學、發酵條件優化、基因定位、結構基因擴增、構建克隆菌株等方面。

在菌株篩選方面，馬國涵等[24]從大菱鲆腸道中，分離篩選出廣譜拮抗活性乳酸菌；王海寬等[25]從傳統發酵制品中篩選出的植物乳桿菌，對霉菌有明顯的拮抗作用；張開屏等[26]從內蒙牧區風干牛肉制品中分離出肉源乳酸菌菌株，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯。

在應用方面，顧彬濤[27]從豬糞便分離乳酸菌，通過抑菌活性和耐受性試驗篩選益生作用良好的乳酸菌菌株，體外實驗應用抑菌效果良好。曹海鵬等[28]從黔北黑豬腸道黏膜分離出益生菌，添加入飼料中，抑菌效果明顯。

3 乳酸菌細菌素的抑菌特性[29]

乳酸菌細菌素是乳酸菌代謝產生的具有抗菌活性的蛋白質、多肽類物質，乳酸菌對其產生的細菌素具有免疫性。普遍認為細菌素的抑菌分為兩個步驟，先是細菌素專一的吸附到細胞表面的受體上，然后與細胞特異性或非特異性受體結合，最后殺菌。不同結構的乳酸菌細菌素，抑菌作用方式和活性也不同。

3.1 羊毛硫細菌素抑菌特性

Nisin是一個帶正電荷的陽離子分子，在缺乏陰離子膜磷脂的情況下，Nisin起陰離子選擇載體的作用；當存在陰離子膜磷脂時，Nisin吸附在膜上，利用離子間相互作用，及其分子的C末端和N末端對膜結構產生作用形成穿膜“孔道”，從而引起胞內物質泄漏，導致細胞解體死亡。Nisin對營養細胞的作用點是細胞質膜。它能抑制細胞壁中肽聚糖的生物合成，使細胞壁質膜和磷脂化合物合成受阻，引起細胞內含物和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）外瀉，使細胞裂解。張玉鑫等[30-31]認為，Nisin具有潛在的跨膜序列及高的偶極矩能使膜產生孔道，同時使膜內外電位差和梯度喪失，破壞細胞通過電子傳遞鏈產生能量的能力。

3.2 小分子熱穩定肽抑菌特性

Ⅱa類細菌素的抑菌機理與Nisin不同，其抑菌機理主要是由于細菌素吸附在細胞膜上并形成孔道，增加了細胞膜的通透性，引起細胞內各種離子的滲漏和能量物質的消耗，導致細胞解體死亡。Ⅱa類細菌素N端的發夾結構（Tyr-Gly-Asn-Gly-Val，YGNGV）可為細胞膜上的蛋白受體特異識別，使發夾結構帶正電荷的β折疊與膜上帶負電荷的磷脂以靜電引力結合到靶細胞上。當Ⅱa類細菌素結合到敏感細胞膜上后，膜上的脂質酞基與疏水性的C端發生反應，并插入膜內聚集形成充水的膜孔道[32-35]。

Ⅱa類細菌素在細胞膜上形成孔道，導致膜內外離子失衡，磷酸鹽的滲漏。膜內外離子的失衡使得質子驅動力（proton motive force，PMF）的耗散，而PMF可影響pH梯度（△pH）和跨膜電位（△Ψ）[36-39]。YAMAZAKI K等[40]報道，盡管在質膜上的成孔機理不同的細菌素不盡相同，但抗菌模式都是一樣的。

3.3 熱敏感大分子蛋白細菌素抑菌特性

熱敏感大分子蛋白細菌素由乳桿菌屬產生，有lacticin A、lacticin B、helveticin J和caseicin 80[41]等。目前對熱敏感大分子蛋白細菌素的研究報道不多，EIJSINK V等[42]研究認為，熱敏感大分子蛋白細菌素轉運、修飾加工和免疫的基因應該與hly J基因緊密連鎖。

3.4 大分子復合細菌素抑菌特性

許多學者在研究細菌素的過程中，先后發現了一些拮抗物質[43]，它們是某些細菌代謝產生的蛋白或多肽類物質，除了能抑制革蘭氏陽性菌外，還能抑制革蘭氏陰性菌和真菌，1958年，這類物質被國外的學者命名為類細菌素（bacteriocins-hkesubstance），并對其開始研究。在國外，類細菌素的研究與應用已日趨成熟；在我國，類細菌素的研究和生產尚處于初級階段[43]。隨著人們的不斷深入研究，越來越多的類細菌素將被開發出來，以其抑菌譜寬、高效、安全的特點越來越受到食品工業的青睞。

4 乳酸菌細菌素的應用

4.1 在乳制品中的應用

乳制品營養豐富，是微生物良好的培養基，極易發生腐敗變質。乳制品屬于熱敏性的物料，巴氏殺菌雖避免了高溫殺菌對營養物質的損失和風味的改變，但乳制品中仍殘留一部分細菌和耐熱芽孢，并產生一定的毒素，縮短了乳制品的貨架期，加入乳酸菌細菌素雖不能殺死芽孢桿菌，但可以抑制其生長，使其不產毒素，從而達到延長乳制品保質期的目的。

植物乳桿菌的代謝產物在乳制品中應用廣泛，被歸類于非發酵劑乳酸菌[44]，對保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的生長在某些條件下具有抑制作用[45]，常用于預防酸奶后酸化。李紅娟等[46]從發酵乳制品中分離出具有抗青霉特性的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），并應用于乳品中，抗青霉效果良好。

4.2 在肉制品中的應用

在肉制品的保藏中，傳統使用亞硝酸鹽和硝酸鹽等抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的生長，當人們食用肉制品時，一部分亞硝酸鹽也進入人體，并與體內的胺類物質作用，生成一種強烈的致癌物質—亞硝胺化合物。Nisin能抑制肉制品中微生物的生長，尤其是抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的生長。Nisin本身在酸性活性最強，能降低肉制品的pH值，低pH值能降低殘留亞硝酸鹽的含量，避免對人體的危害，保證肉制品安全[47]。

PAIK H D等[48]研究添加Nisin在牛肉制品中保藏期間的質量變化情況。添加Nisin的處理組和對照組比較，添加Nisin的處理組與對照組相比嗜熱微生物數量顯著降低，在牛肉制品的顏色上，對照組與添加Nisin的處理組相比，對照組牛肉顏色變化明顯。Nisin在肉制品中主要應用于香腸、冷卻肉、真空包裝的新鮮牛肉、咸豬肉、熏豬肉、火腿等的保藏中。吳學友等[49]采用對李斯特菌具有專一抑制作用的乳酸菌細菌素處理冷鮮雞肉進行儲藏試驗，研究發現可有效延長冷鮮雞肉儲藏期。方士元等[50]研究發現，乳酸菌細菌素對海水魚保鮮有延長貨架期的效果。

4.3 在啤酒釀造中的應用

啤酒的營養豐富，是微生物良好的培養基，但啤酒生產中如消毒處理不善，極易受到啤酒片球菌（Pediococcus cerevisiae）和乳酸桿菌的的污染，造成啤酒渾濁、發黏、酸變等現象，引起風味發生改變。而加入乳酸菌肽可殺死雜菌，又不抑制酵母菌的生長，還可以延長啤酒的貨架期。

將Nisin加入擴大培養啤酒酵母菌所用的冷麥汁中，可殺死酒母中的革蘭氏陽性細菌，使酒母免受污染。在發酵醪中加入Nisin，可以抑制發酵過程中片球菌、乳桿菌等雜菌的生長；在啤酒釀造過程中，傳統的酸洗法降低了酵母菌的發酵力、生命力和凝聚力，如果在釀造過程中添加Nisin，可殺死酵母菌中污染的乳酸菌，而酵母菌則不受影響；在生啤中添加Nisin，無需巴氏殺菌，就能將桶裝或瓶裝啤酒的貨架期延長1～2倍；在熟啤酒添加Nisin，可以降低滅菌的強度，節省能源，改善啤酒口味，降低蒸汽消耗量。

4.4 在罐頭食品中的應用

在酸性條件下，Nisin的溶解度、穩定性和活性都增強，因而高酸性食品的防腐可添加Nisin。在低酸和非酸性罐頭食品中添加Nisin，可減輕殺菌強度，節約能耗。常規的罐頭食品，在殺菌處理時很難將耐熱細菌芽孢，如熱解糖梭菌（Clostridium thermosaccharolyticum）的耐熱芽孢和嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）徹底殺死，條件適宜時，它們就會生長繁殖，導致罐頭腐敗，需要更高強度的熱處理才能將它們殺死，但溫度過高對產品的外觀、營養價值和風味都會產生不良影響，如在罐頭食品中添加Nisin，可有效抑制耐熱芽孢的生長繁殖，延長罐頭食品的保質期。如在某些果蔬罐頭食品中添加Nisin，降低殺菌強度，可有效保持果蔬罐頭的組織脆度、營養風味和食用品質。

4.5 在焙烤食品中的應用

焙烤食品有蛋糕、面包、烤餅等，主要以面粉為原料，經和面、發酵、焙烤、冷卻、包裝而成。焙烤食品因產氣菌和霉菌的繁殖多數會發生腐敗變質問題，降低保質時間。很多商家為了延長保質期采用添加山梨酸鉀，抽真空或氣調包裝，低溫貯存，但是這些方法對耐熱細菌如蠟狀芽孢桿菌等不起作用，蠟狀芽孢桿菌在焙烤食品中生長引起食物中毒的事故屢見不鮮，如在焙烤食品加工過程中添加乳酸鏈球菌素（Nisin）可以防止細菌的繁殖和生長，有效延長焙烤食品的保質期。

4.6 在抗菌保鮮材料中的應用

抗菌食品包裝是食品包裝中最有發展前景的一種包裝方法，是未來最廣泛應用的活性包裝之一。抗菌包裝材料是以生物降解的可再生高分子為載體，將乳酸菌細菌素混入一種或幾種可再生高分子包裝材料中，從而使其具有抗菌活性。其中的乳酸菌細菌素可從包裝材料上逐漸釋放到食品表面，當乳酸菌細菌素與細菌體接觸時，可滲透到細胞壁，抑制其生長。因此，抗菌包裝材料能殺死或抑制食品在加工、儲運和處理過程中存留于表面的微生物，延長食品的貨架期。而添加到包裝材料中的乳酸菌細菌素則是賦予包裝材料抗菌活性的關鍵[51-53]。在包裝材料中加入乳酸菌細菌素制成抗菌包裝材料，將包裝材料作為活性物質的釋放載體，實現活性物質（Nisin）的逐漸釋放，能最大限度的保持食品的營養、風味，延長食品的貨架期，抗菌包裝材料在食品中的應用將有廣闊的發展前景。

4.7 在飼料工業中的應用

近年來，我國畜禽養殖業發展迅速，規模擴大，飼料工業發展迅猛，如能防止致病菌對飼料的污染，就能在很大程度上遏制致病菌對動物的危害，所以，研究人員經過大量試驗發現，在飼料中添加細菌素，可以防止飼料本身被致病菌污染，抑制帶菌動物糞便中的病原微生物傳播，還可以抑制動物腸道中病原菌的生長。

細菌素本身具有良好的性質，殺菌具有選擇性、無抗藥性、無毒副作用、無殘留、不污染周圍環境、對熱穩定，在動物消化道內易被降解，不會在動物體內蓄積引起不良反應，能很好的保持飼料的營養價值和風味。飼料中添加細菌素對豬、牛、雞、鴨等動物胃腸疾病的防治起到了積極的作用，得到越來越多人的接受和支持。

4.8 在醫藥工業中的應用[54-56]

乳酸菌細菌素對革蘭氏陽性菌致病菌和部分革蘭氏陰性菌致病菌有抑制作用，如金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella castellani）、單孢增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、大腸桿菌（Escherichia coli）和綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）等均有抑制作用，可以治療腸炎、胃炎等。乳酸菌細菌素能使人體胃液分泌增多，促進胃腸蠕動，加快食物消化，可以治療因消化不良引起的腹瀉、腹脹、胃腸炎等。乳酸菌細菌素能選擇性的殺死腸道致病菌，改善腸道環境，調節胃腸道正常菌群平衡；乳酸菌細菌素能選擇性殺死腸道致病菌，增加機體的特異性和非特異性免疫物質，促進有益菌生長的免疫調節作用。乳酸菌細菌素能刺激腸道產生免疫球蛋白，增強機體的細胞免疫，提到腸道免疫力。

5 結語

關于乳酸菌細菌素的研究主要集中在提取與分離鈍化上，對其穩定性和功能性的研究方面欠缺，今后將在這些方面加大研究力度。乳酸菌細菌素目前作為食品添加劑使用，并在多種食品中成功應用。乳酸菌細菌素作為天然的功能性防腐劑具有安全、無毒、環保，抑菌譜寬、穩定性強等特色，在食品、調味品中展現出較好的開發前景。隨著科技的快速進步，新技術新方法的不斷研究，乳酸菌細菌素制品品質越來越高，給乳酸菌細菌素在食品工業上的應用帶來新的機遇。