DNA甲基轉移酶在急性髓系白血病中作用的研究進展*

姜慧慧，楊 新，弭苗苗，辛 鈺，武洪遠 綜述，孫成銘△ 審校

1.青島大學醫學部，山東青島 266000；2.青島大學醫學院附屬煙臺毓璜頂醫院，山東煙臺 264000；3.濱州醫學院，山東煙臺 264000

急性髓系白血病(AML)是來源于造血系統的髓系原始細胞惡性增殖性疾病，其發病率高、復發率高、預后差。大多數AML的病因不明，可能與高齡、吸煙、接觸化學品、骨髓增殖性腫瘤、化療藥物、高劑量輻射暴露和家族史等危險因素有關[1]。近年研究顯示，異常的表觀遺傳改變在AML發病過程中起重要作用，表觀遺傳改變主要包括DNA甲基化、組蛋白末端修飾和非編碼RNA的變化，這些變化可以導致轉錄或轉錄后基因的沉默或激活，從而調控基因表達[2]。DNA甲基化是最具特征性的表觀遺傳修飾，在哺乳動物中，DNA甲基化通過轉錄調控以維持基因組穩定性、基因組印跡、X染色體失活等[3]。異常DNA甲基化與腫瘤的發生、發展密切相關，DNA低甲基化引起癌基因的過表達是癌癥發生的重要原因，DNA高甲基化可導致關鍵的抑癌基因沉默，從而導致細胞生長失調或對癌癥治療反應改變。在健康造血干細胞中，表觀遺傳過程在細胞分化和造血過程中起關鍵作用。腫瘤基因組圖譜顯示，近44%的AML患者攜帶DNA甲基化相關的基因突變。DNA甲基轉移酶(DNMT)是高度保守的DNA修飾酶，在正常造血過程中，DNMT在造血干細胞的自我更新和多系造血分化等過程中發揮重要作用，研究DNMT有助于揭示DNA甲基化參與AML發生的機制。哺乳動物有3種具有酶活性并負責參與DNA甲基化修飾的DNMT，即DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。現就DNMT1、DNMT3A、DNMT3B在AML中的作用研究進展綜述如下。

1 DNMT1在AML中的作用

DNMT1是細胞中含量最豐富的DNMT，因在細胞周期的S期高表達，所以成為癌癥快速分裂細胞中甲基化抑制的特異性靶標[4]。DNMT1在AML中是一個潛在的癌蛋白，研究表明，抑制DNMT1表達后，癌細胞的增殖、侵襲和轉移受到抑制，這主要是由于RAS相關結構域包含蛋白1(RASSF1A)和死亡相關蛋白激酶(DAPK)啟動子的甲基化水平降低所致[5]。

1.1miRNA對DNMT1的調控作用 DNMT1是miRNA介導腫瘤進展的靶基因之一，并且DNMT1和miRNA之間可能存在著相互作用的表觀遺傳回路。miRNA異常上調或下調與惡性腫瘤的發生、發展有關。WANG等[6]報道，DNMT1在AML細胞系中受到miR-148a的負調控，DNMT1的抑制導致miR-148a啟動子中5′-胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤-3′島的甲基化水平降低，從而導致miR-148a表達升高，進而抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。但有的miRNA并不直接靶向調控DNMT1，有研究報道，miR-29b可通過靶向其調控因子Sp1來間接下調DNMT1表達[7]。miRNA和DNMT1在AML中的關系和生物學功能仍有待闡明，在AML患者中驗證這些結果仍需要進一步證實。

1.2DNMT1對抑癌基因p15的誘導作用 過表達的DNMT1可能通過誘導抑癌基因的高甲基化參與AML的發生、發展。DNMT1參與AML的一個關鍵致病機制就是通過介導p15INK4B的甲基化從而下調p15INK4B在AML中的表達[8]。MIZUNO等[9]的研究證實了具有甲基化p15INK4B的AML患者有表達更高水平DNMT1的趨勢，并且啟動子的高甲基化會導致疾病向更具侵襲性的表型轉化。由于DNMT1經常通過作用于p15的啟動子區域而下調p15的表達，因此，p15水平升高可作為衡量AML中DNMT1活性受損的指標。

1.3DNMT1與其他調節因子的相互作用 作為DNMT1基因表達的重要調節因子，核仁素的過表達常出現在癌癥中，且其表達量與臨床預后呈正相關。核仁素-核因子-κB(NF-κB)-DNMT1調節軸是導致AML發生的一條分子途徑，這一過程中，核仁素直接激活NF-κB信號而上調DNMT1基因轉錄，進而發生DNA高甲基化。當核仁素失活會使NF-κB去磷酸化并抑制DNMT1的表達，從而降低了p15INK4B的整體甲基化水平，恢復p15INK4B的表達[10-11]，這為將核仁素作為AML的表觀遺傳治療藥物提供了有利的理論基礎。另外，細胞脂肪酸結合蛋白4(FABP4)上調會通過增強依賴于DNMT1的DNA甲基化來促進AML的侵襲性。YAN等[10]的研究證明DNMT1能通過高活性的血管內皮生長因子信號反饋上調FABP4，利用選擇性FABP4抑制劑BMS309403可逆轉異常的DNA甲基化而重新激活沉默的p15INK4B，從而誘導AML細胞的分化。這表明FABP4可能是一種新的白血病藥物候選分子，以FABP4-DNMT1軸為靶點是開發DNA去甲基化藥物的新策略。

1.4蛋白激酶對DNMT的作用 不僅miRNA、NF-κB、核仁素、FABP4等是DNMT1基因表達的重要調節因子，蛋白激酶被發現也能夠磷酸化和穩定DNMT1，導致DNMT活性增強[12]。隨后有研究發現，在白血病細胞中，DNMT的表達與受體酪氨酸激酶(RTK)的表達呈正相關，RTK是DNMT1依賴的DNA甲基化的正調節因子。RTK功能障礙會降低DNMT表達，減少DNA甲基化，從而激活表觀遺傳沉默的p15INK4B，使白血病細胞的生長受到抑制[13]。這也為RTK抑制劑治療白血病表觀遺傳異常提供了新的途徑?？傊珼NMT1是AML表觀遺傳治療的一個潛在靶點。

2 DNMT3A在AML中的作用

DNMT3A在血液系統惡性腫瘤中的作用日益受到重視，大約20%的成人AML患者存在DNMT3A突變[14]。DNMT3A突變主要發生在第882位的精氨酸(R882)上，其中R882H最常見，占患者的70%～80%[15]。DNMT3A R882突變會導致患者呈現全基因組低甲基化狀態，并且低甲基化主要發生在非CpG島區域，這是因為DNMT3A R882突變通常以顯性-負性方式作用于突變蛋白，突變蛋白干擾野生型DNMT3A形成活性四聚體的能力，抑制自身酶的活性，使DNMT3A突變患者呈現出全基因組的低甲基化狀態[16]。

2.1DNMT3A突變與其他基因突變的協同作用 AML的分子突變之間通常存在相互作用的網絡，因為DNMT3A突變本身可能不足以引起惡性腫瘤，而是需要額外的遺傳擾動才能轉化為白血病細胞。DNMT3A突變常常伴隨著AML中其他基因的突變，如FLT3、NPM1、IDH1和IDH2[17]。在AML中，約30%的DNMT3A突變患者存在FLT3-ITD，約60%的DNMT3A突變患者存在NPM1突變[18]。YANG等[14]認為部分DNMT3A缺失會與FLT3-ITD協同作用，導致具有單核細胞和中性粒細胞偏向的AML，這也為DNMT3A突變與M4及M5的關聯提供了依據。為證實DNMT3A突變與其他分子的協同作用，YANG等[14]還在具有FLT3-ITD過表達的DNMT3A基因敲除小鼠中進行功能研究后發現，該模型中造血干細胞獲得DNMT3A突變，該突變會擴大并成為克隆擴張的儲存庫，直到獲得另一個導致轉化的遺傳損傷如FLT3-ITD，進而轉化為AML細胞。

2.2DNMT3A缺失損傷細胞功能 雖然DNMT3A的單一突變不會演變成白血病或者改變甲基化水平，但研究發現在小鼠模型中完全敲除DNMT3A也會產生抑制細胞分化等細胞功能的損傷，CHALLEN等[19]認為這主要是由于DNMT3A下游調控因子如Runx1、Gata3的上調，正常造血干細胞中Runx1和Gata3的過表達均會導致分化抑制。此外，DNMT3A的甲基轉移酶活性是PML-RARα驅動的異常體外自我更新所必需的，并且DNMT3A對于Runx1-Runx1T1和MLL-AF9驅動的自我更新都是必不可少的[20-21]?？梢哉fDNMT3A缺失可以誘發AML等血液疾病，但如果加入其他分子的協同作用后，可能誘發為更急性、兇險的惡性腫瘤。

2.3DNMT3A突變與預后不良相關 DNMT3A突變被普遍認為是AML不良預后的獨立預測因子。有研究顯示，DNMT3A突變患者的復發率明顯高于未突變患者，總體生存期(OS)和無復發生存期(RFS)也明顯短于未突變患者[22]。且有研究顯示，許多接受化療藥物的AML患者在獲得完全緩解(CR)后還仍然存在DNMT3A R882突變，這是因為突變可能發生在早期造血干細胞中，并與正常核型的AML有關，這種細胞在骨髓中分化為淋巴系和髓系，并進行克隆性擴增從而抑制正常造血干細胞[23]。甚至有的存在DNMT3A突變的AML患者，在CR時突變消失，但是在復發時又再次檢測到突變[24]。這意味著DNMT3A突變可能是AML持續復發的重要因素，并且可能是監測微小殘留病的潛在生物標志物。

3 DNMT3B在AML中的作用

與DNMT3A的高突變率相比，DNMT3B在血液系統惡性腫瘤中很少發生突變，研究者對DNMT3B突變的研究也比較少。有研究應用高分辨熔融分析(HRM)技術對137例AML患者DNMT3B的8～23外顯子進行檢測后并未發現突變，這提示DNMT3B在AML中不易發生突變[25]。但也有例外，有研究者在AML中發現了兩個DNMT3B截短突變，一個( p.1622fs)發現于AML del(9q)患者，另一個(p.R571X)是在AML t(8；21)患者中發現，這兩個突變被認為可能是AML發生的驅動因素[26]。

3.1DNMT3B與miRNA的相互作用 一些miRNA，包括miR-29a、miR-29b、miR-148a、miR-106a/b、miR-375和miR-147與DNMT3B的表達密切相關[26]。在所有相關的miRNA中，miR-29b最具特征性。miR-29b直接與DNMT3B的30個非翻譯區相互作用，并下調其表達，從而導致高甲基化和沉默的p15INK4B在AML細胞中重新表達[27]。miR-375-Hoxb3-CDCA3/DNMT3B這個復雜的信號通路也被證實與AML的發生、發展密切相關，其中miR-375起著重要的基因表達調控因子的作用，Hoxb3-CDCA3/DNMT3B信號通路參與白血病的發生和維持[27]。如果抑制此信號通路可能恢復miR-375的表達以改善AML患者的治療效果。

3.2DNMT3B過表達與預后不良相關 雖然DNMT3B突變在AML不常見，但是在正常核型的AML中，DNMT3B的過度表達可能是患者預后較差的分子生物學指標，并與較低的CR率、較短的無病生存期(DFS)和OS有關。2012年有研究報道了DNMT3B過度表達是AML患者生存不良的獨立預測因子，分析了195例初治AML患者DNMT3A、DNMT3B的表達后得出結論，DNMT3B過表達與OS顯著相關，與DFS呈負相關[24]。NIEDERWIESER等[28]對細胞遺傳學正常的老年AML患者的多變量分析也證實DNMT3B高表達是較低CR率、較短DFS和OS的獨立預測因子，但具體機制還有待研究。

3.3DNMT3B抑制腫瘤的進展 盡管有證據證實DNMT3B在AML中是一個潛在的癌蛋白，但有趣的是，有研究者發現DNMT3B在AML進展過程中還起著腫瘤抑制因子的作用[29]。ZHENG等[29]通過敲除小鼠MLL-AF9 AML白血病細胞中的DNMT3B，證明了DNMT3B缺失可通過增加干細胞和促進細胞周期進程來加速MLL-AF9 AML的進展。相反，DNMT3B在AML細胞中的過表達延長了AML受體的潛伏期，降低了急性髓系白血病干細胞(LSCs)的比例。因此，DNMT3B在AML進展過程中可能起著抑制腫瘤的作用，這也提示DNMT3B在功能上可能與其他DNMT不同，深入研究DNMT3B對AML的影響很有必要。

盡管對白血病的遺傳學和表觀遺傳學研究取得了很大進展，但 AML仍是一種發病率高、復發率高、預后差的血液系統惡性腫瘤。DNA甲基化是重要的表觀遺傳機制，DNMT是DNA甲基化建立和維持所必需的酶，了解DNMT在AML發病機制中的作用對臨床治療具有重要意義。雖然表觀遺傳調節在AML的治療中是有效的，但這些表觀遺傳治療藥物在體內的確切效果尚未得到詳盡闡述，因此，對DNMT的深入研究對于推動該領域的發展至關重要，在該研究領域的進一步探索也將為AML的表觀遺傳療法提供更多的靶向藥物和治療途徑。