陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥的實驗室檢查

曾順良 綜述，曾 濤 審校

1.潮州衛生學校，廣東潮州 521041；2.廣東省惠州市第一人民醫院檢驗科，廣東惠州 516001

陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是后天獲得性干細胞疾病，是部分造血干細胞磷脂酰肌醇聚糖A(PIG-A)基因突變及其非惡性克隆所致。PIG-A基因突變的造血干細胞經克隆及多向分化，將缺陷經各系祖細胞依次傳導至下游各階段血細胞，使其性能改變而致PNH患者產生慢性(陣發性)血管內溶血、外周血細胞減少、血栓形成等各異的主要臨床表現[1-3]。正常PIG-A基因表達的糖基轉移酶是血細胞膜糖化磷脂酰肌醇(GPI)合成的關鍵酶[4]。異常PIG-A基因表達的蛋白，部分或全部不具有糖基轉移酶功能，導致血細胞膜GPI合成障礙，使包括抑制補體溶細胞效應的同源抑制因子(衰變加速因子/CD55、膜反應性溶血抑制物/CD59)在內的一組GPI錨連蛋白，在血細胞外膜表現為部分缺失或全部缺失。CD55、CD59缺失程度決定PNH紅細胞對補體溶細胞效應的靈敏度[5]，也是PNH紅細胞分為正常敏感的Ⅰ型、中度敏感的Ⅱ型及高度敏感的Ⅲ型的依據[6]。高度敏感的Ⅲ型紅細胞多寡是血管內溶血嚴重與否的關鍵因素。

PIG-A基因突變的造血干細胞克隆大小存在差別、異常克隆占比高低與正常克隆并存等，使不同患者或是同一患者在疾病不同階段的表現各異，易致誤診、漏診。隨著發病機制研究的不斷深入、實驗室檢查多種技術的聯合應用，PNH的診治得以進一步完善。本文就PNH實驗室檢查綜述如下。

1 初篩性實驗室檢查

1.1外周血細胞及相關參數檢查 多數PNH患者有不同程度的貧血，可呈正色素性貧血或低色素性貧血(尿液丟失鐵過多時)；常伴有白細胞計數、血小板計數減低，網織紅細胞常增高，但骨髓增生減低時，網織紅細胞可減低。

1.2血管內溶血檢查

1.2.1尿液檢查 尿含鐵血黃素檢查又稱Rous試驗，用于定性篩查慢性血管內溶血。血管內溶血釋放的血紅蛋白通過腎臟濾過排出時，可被腎小管上皮細胞吸收、分解，并以含鐵血黃素形式沉積于腎小管內，這種細胞經普魯士藍反應呈現即為Rous試驗陽性。有研究發現，Rous試驗的靈敏度可達73%[7]。慢性溶血發病初期，腎小管上皮細胞內含鐵血黃素低于檢測下限，或是含鐵血黃素上皮細胞未脫落至尿液排出，Rous試驗皆可呈陰性。此外，血管內溶血發作時，尿血紅蛋白及潛血為陽性。因此，應注意PNH患者陣發性血管內溶血的特點，分時段多次采集尿標本檢查其含鐵血黃素、血紅蛋白、潛血，以免漏檢。

1.2.2生化檢查 血管內溶血發作期內，外周血可出現游離血紅蛋白、血清乳酸脫氫酶、間接膽紅素水平等增高及結合珠蛋白水平降低。

1.3蔗糖溶血試驗 依據PNH患者紅細胞在含補體、低離子強度的高滲蔗糖溶液中發生滲透性溶血而設定。靈敏度較高、陰性可排除PNH，但特異性不強，易出現假陽性。部分自身免疫性溶血性貧血、巨幼細胞性貧血等可有假陽性[8]，陽性者必須通過酸化血清溶血試驗或檢測PNH克隆標志加以確證。

2 確證性實驗室檢查

2.1特異性補體溶血試驗

2.1.1酸化血清溶血試驗 酸化血清溶血試驗又稱Ham試驗，基于PNH補體高敏感型紅細胞于酸性、補體環境中易遭破壞的原理，特異度較高，但陽性率與PNH患者血液中Ⅲ型紅細胞存量有關，且易受輸注正常同型紅細胞、實驗前患者異常細胞破壞程度等的影響。何秋陽等[9]采用Ham試驗檢測40例PNH患者外周血的結果顯示，陽性率為 65.0%，陰性率為35.0%；吳瓊等[10]對7例經新型方法確證PNH患者的研究發現，2例為Ham試驗陰性，應用該試驗診斷PNH時，需要多次重復或輔以其他方法來確證，某些自身免疫性溶血性貧血患者Ham試驗也可為陽性[8]。

2.1.2蛇毒因子溶血試驗 蛇毒激活補體致PNH高度敏感的Ⅲ型紅細胞溶解破壞，陽性率與Ham試驗相近，也受輸血、標本中異常細胞存量等的影響。

2.2新型確證試驗

2.2.1CD55、CD59檢測 CD55、CD59缺失是PNH細胞典型表現及PNH患者溶血的致病因素，故常將其作為PNH克隆的標志。隨著流式細胞術和熒光標記單克隆抗體技術的發展，利用流式細胞儀檢測外周血細胞CD55、CD59缺失用于PNH診斷、預后判斷，成為目前臨床上可靠、常用的方法[11-13]。

PNH造血干細胞多向分化，使PIG-A基因突變，除紅細胞外還會累及粒細胞、單核細胞等。外周血白細胞不受輸注正常紅細胞的影響，白細胞尤其是占比最高的粒細胞錨連蛋白檢測對于診斷PNH，比單獨檢測紅細胞更有價值[10，14-15]，但外周血粒細胞檢測CD55、CD59仍受骨髓衰竭致外周血細胞減少的影響。有研究指出，檢測骨髓紅系、粒系細胞的CD55、CD59比外周血更有意義[16]。PIG-A基因突變克隆的造血干細胞在骨髓中逐步分化發育，歷經祖細胞、原始細胞、幼稚細胞、成熟細胞等及成熟階段釋放至外周血，不難看出，骨髓中出現血細胞CD55、CD59缺失早于外周血。故以CD55、CD59檢測診斷PNH時，除開展外周血多種細胞組合檢測外，還可檢測骨髓紅系、粒系細胞，以供早期診斷及避免漏診，但目前仍缺乏檢測骨髓CD55、CD59用以診斷PNH的定量標準。

2.2.2GPI錨連蛋白檢測 (1)嗜水氣單胞菌毒素(HEC)溶血試驗。嗜水氣單胞菌產生具有溶血、細胞毒性等生物活性的毒素，簡稱HEC，能特異性結合GPI錨連蛋白并與之形成異源多聚物膜通道致正常紅細胞溶解破壞，留存GPI錨連蛋白缺失的PNH細胞，此研究為PNH確證試驗的發展奠定了基礎。有研究顯示，國內學者應用HEC溶血試驗與流式細胞術檢測CD59缺失細胞進行比對，得出HEC溶血試驗PNH細胞留存率與流式細胞術CD59缺失檢測率一致的結論[17-18]。HEC溶血試驗多為手工法，不需昂貴儀器，但尚無統一的方法流程及標準，且難以進行質量控制。(2)熒光標記氣溶素(FLAER)技術。綠色熒光染料Alexa-488標記嗜水氣單胞菌溶素前體變異體簡稱FLAER。FLAER能特異性標記血細胞GPI錨連蛋白，但不致血細胞溶解破壞，是近年來國內外用以佐證特異性補體溶血試驗、CD59等缺失及診斷PNH的新技術。梁悅怡等[19]應用FLAER多參數與 CD59缺失對比檢測9例PNH患者發現，FLAER檢測結果明顯高于CD59缺失檢測，其中2例FLAER缺失率分別為88.1%、23.2%，而CD59缺失率僅分別為7.8%、5.5%。楊柯等[20]對22例PNH患者采用多參數流式細胞儀同時檢測外周血粒細胞CD55缺失、CD59缺失和FLAER陰性細胞比例，作為檢出PNH的克隆數,結果顯示，FLAER技術檢測FLAER陰性細胞的檢出率及克隆數均依次高于CD55缺失、CD59缺失。FLAER技術比檢測CD55、CD59更敏感[21-22]，對一些無血紅蛋白尿、尿含鐵血黃素等溶血證據、特異性補體溶血陰性、不能檢出CD55及CD59缺失但臨床上高度懷疑的病例，可用FLAER技術佐證或排除。

3 PNH實驗室檢查的建議

3.1鑒別 目前，實驗室檢查是診斷PNH的主要手段，基本流程為先初篩再確證。初篩性實驗室檢查結果并非PNH特有，應注意加以鑒別：多數白血病、惡性組織細胞病、再生障礙性貧血、巨幼細胞性貧血、脾功能亢進、骨髓增生異常綜合征等可有外周血全血細胞(或一系、二系)減少的表現；內在缺陷或外在因素導致的急、慢性血管內溶血均有網織紅細胞升高(骨髓衰竭除外)及上述生化指標異常、尿潛血陽性；自身免疫、藥物等因素可引起慢性持續性血管內溶血而致Rous試驗陽性。

3.2PNH確證方法的選擇 我國制定的PNH診斷標準顯示，血管內溶血檢查如尿隱血、含鐵血黃素試驗等，傳統特異性補體溶血試驗如酸化血清溶血試驗、蔗糖溶血試驗、蛇毒因子溶血試驗等，均是其診斷的重要方法[6]。PNH診斷標準還將外周血中性粒細胞或紅細胞CD55缺失或CD59缺失>10%(5%～10%為可疑)作為確證試驗。因此，應根據診斷需求、所在實驗室的具體條件、相關試驗的優缺點，選擇適宜的PNH確證方法。就基層醫療衛生機構的實驗室而言，不需要昂貴儀器和試劑，選擇特異度較高的補體溶血試驗，仍不失為較理想的初診方法，需進一步確證分型時可將標本送至上級醫院或第三方檢驗機構；對于三甲以上醫院的實驗室，則可在傳統試驗的基礎上，聯合應用CD55缺失、CD59缺失檢測及FLAER技術，提高診斷的靈敏度。