基于網絡藥理學探討七味白術散治療脾虛泄瀉的潛在機制

張慧婷 楊文波 沈丹平 馬 聰

腹瀉是我國嬰幼兒最常見的疾病之一，臨床多表現為大便次數增多和大便性狀改變，按照病程長短可分為急性腹瀉、遷延性腹瀉和慢性腹瀉[1-3]。該病歸屬于中醫學泄瀉范疇，其中脾胃虛弱是泄瀉發生的重要病因病機，臨床常以病程較長、大便稀溏為辨證要點[4]，代表方為七味白術散[5]。本研究運用網絡藥理學方法，構建七味白術散成分-靶點及網絡，分析其治療脾虛泄瀉的潛在機制，為實驗驗證其具體機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 七味白術散藥物成分及靶點篩選 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/index.php）、中醫藥綜合數據庫（TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/）查找七味白術散各藥物組成的具體成分，對所搜集到的化學成分進行整合，以口服生物利用度（OB）≥30%[6]，類藥性（DL）≥0.18[7]為標準進行篩選，整理出具有活性成分的中藥化合物。隨后在上兩種數據庫中對各成分的潛在靶點進行查找。

1.2 脾虛泄瀉相關靶點構建 在人類基因組數據庫（GeneCards，https://www.genecards.org/）、人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https://omim.org/）中，以“Diarrhea”為關鍵詞進行檢索，查找脾虛泄瀉相關靶點信息，構建七味白術散-脾虛泄瀉-潛在靶點網絡圖。

1.3 七味白術散潛在靶點預測及成分-靶點網絡構建 取七味白術散各藥物的潛在靶點和脾虛泄瀉相關靶點相交集的部分，作為七味白術散治療脾虛泄瀉的活性化合物和潛在治療靶點，再利用網絡圖編輯軟件（Cytoscape）進一步構建七味白術散藥物-脾虛泄瀉-靶點網絡圖。

1.4 蛋白質互作分析網絡構建 利用臨近基因重復實例的搜索工具（STRING，https://string-db.org/）對七味白術散治療脾虛泄瀉潛在靶點進蛋白質互作分析，為了獲得更高的準確性，選取了最高置信度0.9進行評分。利用Cytoscape 找出相關度較高的基因，并構建靶點網絡圖。

1.5 七味白術散-脾虛泄瀉-靶點圖構建 在得到七味白術散與脾虛泄瀉的共同靶點后，我們篩選出七味白術散治療脾虛泄瀉的有效活性成分，并使用Cytoscape 構建了七味白術散-脾虛泄瀉-關鍵基因靶點網絡圖。

1.6 關鍵靶點功能注釋 利用基因注釋與分析數據庫（Metascape，https://metascape.org/）對潛在治療靶點進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集及基因本體論（GO）功能分析，并使用微生信數據庫（Bioinformatics，http://www.bioinformatics.com.cn/）對主要KEGG 通路和GO 功能進行可視化分析。

2 結果

2.1 七味白術散活性成分篩選結果 從TCMSP、TCMID 中檢索七味白術散各組成的化學成分，其中人參190 種，茯苓34 種，白術55 種，甘草280 種，藿香94 種，木香106 種，葛根18 種，共檢索出化合物777 種。以OB≥30%，DL≥0.18 為標準進行篩選，并去除重復成分后共計157 種，其中人參22 種，茯苓15 種，白術7 種，甘草92 種，藿香11 種，木香6 種，葛根4 種。

2.2 七味白術散藥物潛在靶點和脾虛泄瀉疾病靶點網絡構建 通過TCMSP 數據庫篩選藥物各活性組分的治療靶點。我們共獲得了七味白術散66 個治療脾虛泄瀉的有效活性成分，通過蛋白質數據庫（Uniprot）對篩選出來的靶點進行分析和注釋，轉換成基因名并刪除重復值后，獲得潛在治療靶點共261個。在GeneCards 數據庫中以關鍵詞“Diarrhea”檢索疾病靶點，以相關性得分（Relevance score）≥10 為標準進行篩選，同時在OMIM 數據庫中進行檢索，兩組數據合并，去除重復值后共獲得疾病靶點348 個。將七味白術散靶點與脾虛泄瀉靶點合并做圖，最終構建出七味白術散-脾虛泄瀉-潛在靶點網絡圖，見圖1。

圖1 七味白術散-脾虛泄瀉-潛在靶點網絡圖

2.3 七味白術散治療脾虛泄瀉靶點構建 運用Bioinformatics 數據庫繪制維恩圖（見圖2），得出七味白術散潛在作用靶點與脾虛泄瀉疾病靶點的共同靶點共47 個，這47 個共同靶點可能是七味白術散治療脾虛泄瀉的潛在靶點。經過進一步篩選，最終構建出七味白術散-脾虛泄瀉的靶點圖，見圖3。

圖2 七味白術散治療脾虛泄瀉潛在共同靶點維恩圖

圖3 七味白術散-脾虛泄瀉-靶點網絡圖

2.4 蛋白互作網絡分析結果 將七味白術散與脾虛泄瀉映射到的47 個潛在靶點進行分析，利用String數據庫進行蛋白互作網絡分析，得到蛋白互作網絡圖（見圖4）。其中節點表示靶點蛋白，邊表示蛋白之間相互關系。使用Cytoscape3.7.2 軟件cytoHubba 插件，然后以相關度（Degree）≥兩倍的中位數，并且相似度（Closeness）和中間性（Betweenness）＞中位數為標準對關鍵基因進行分析和篩選，獲得了12 個關鍵基因。繪制這12 個核心靶點網絡如下（見圖5）。這12 個靶點主要涉及到凋亡、趨化、炎癥、細胞周期、增殖等方面，并且可能為七味白術散治療脾虛泄瀉的核心靶點。

圖4 七味白術散治療脾虛泄瀉治療靶點蛋白互作網絡圖

圖5 七味白術散治療脾虛泄瀉核心靶點互作關系圖

2.5 七味白術散治療脾虛泄瀉核心靶點構建 在得到12 個核心靶點之后，進一步篩選七味白術散各藥物中的活性成分，可以得出共有8 個活性成分映射到這12 個核心靶點上面。通過整理可以構建出七味白術散-脾虛泄瀉-核心靶點網絡圖，見圖6。

圖6 七味白術散-脾虛泄瀉-核心靶點網絡圖

2.6 KEGG 分析及GO 分析結果 使用Metascape將47 個潛在靶點進行KEGG 通路分析及GO 功能富集分析，KEGG 分子中有14 條顯著意義的通路，利用Bioinformatics 繪制成氣泡圖可以看出，Pathways in cancer 是富集數目最多、最顯著的通路（見圖7）。GO 分析分別從分子功能、生物進程、細胞組分三個方面進行。以P＜0.01、最小計數為3、富集因子＞1.5 為標準進行篩選并做圖（見圖8）。在分子功能方面，一共富集到17 條顯著條目，排名靠前的主要有細胞因子受體結合、脂質結合、蛋白激酶結合等；在生物進程方面富集到20 條顯著條目，顯著性較大的主要有對有細胞增殖的負調控、對有毒物質的反應、對傷害的反應等；在細胞組分方面富集到10 條顯著條目，主要有膜筏、細胞質核周區等。

圖7 七味白術散治療脾虛泄瀉靶點KEGG 圖

圖8 七味白術散治療脾虛泄瀉GO 富集BP、CC、MF 三合一圖

3 討論

根據蛋白互作分析圖可以看出，七味白術散治療脾虛泄瀉的潛在靶點有47 個，進一步篩選出的核心靶點有12 個。信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）能夠調節人體免疫，過度激活或失活均會使人體產生疾病[8]，同時STAT3 在自噬、炎癥反應等方面也有作用[9]。白介素1β（IL-1β）是炎癥反應的關鍵介質，對宿主反應和病原體的抵抗起到了至關重要的作用[10]，在炎癥發生時，IL-1β 會通過白介素6（IL-6）介導鐵調素的表達來參與炎癥反應[11]。白介素4（IL-4）在人體中有免疫調節和抗炎的作用，目前對IL-4 靶點的研究主要用于治療變應性疾病方面[12]。研究表明，IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、趨化因子8（CXCL8）與腹瀉的關系非常密切。腹瀉發生時，患者體內炎癥因子IL-6 會大量釋放[13]，在診斷腹瀉時，血液中IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）的水平亦可提供依據[14]。動物實驗表明，腹瀉減輕時，小鼠體內IL-6 水平會降低，IL-2、IL-4 水平會升高[15]，腹瀉在有效治療后，IL-1β 和TNF 的水平會明顯降低[16]，CXCL8 的釋放會導致腸上皮屏障功能的喪失而發生腹瀉[17]。

研究表明，表皮生長因子（EGF）和表皮生長因子受體（EGFR）能夠保護胃腸道黏膜，釋放營養，促進胃腸道黏膜修復[18]。相反，EGF 的受體抑制劑也是引起腹瀉的重要原因[19]。內整流K+通道（AKT1）和腫瘤蛋白P53（TP53）是研究較多的癌基因，在大多數癌癥中均有表達[20-21]，目前尚未檢索到兩者與腹瀉的直接關系，但在癌癥患者的腹瀉治療中仍起著作用[22]。綜上所述，這些核心靶點主要在抗炎、細胞增殖、凋亡、自噬和細胞周期等方面起作用，并與脾虛泄瀉存在密切的相關性。

在KEGG 通路富集分析中，Pathways in cancer是七味白術散治療脾虛泄瀉的潛在核心通路。Pathways in cancer 是癌癥治療中重要的信號通路[23]，包括了血管內皮生長因子（VEGF）、TP53、信號轉導轉錄激活蛋白（Jak-STAT）等信號通路，本研究所富集到 的 核 心 靶 點IL-6、STAT1、STAT3、EGF、VEGF、TP53 等均包含于其中，因此Pathways in cancer 成為富集分數最高的通路。

在GO 功能分析中，細胞因子活性是富集到的主要細胞功能活動，而細胞因子與炎癥性疾病的發生有著密切的關系[24]。在蛋白互作分析中，分析到的核心靶點如TNF、STAT3、IL4、IL-6 等均與炎癥反應相關。細胞增殖的負調控是GO 功能富集到的主要生物進程，研究表明大腸桿菌在胃腸道感染中能夠抑制腸細胞的增殖，VEGF 對增殖的負調控是動物胃腸炎的發生機制之一[24]，目前暫未發現有文獻提出這些生物進程在脾虛泄瀉方面具有作用，但為實驗研究這些功能在脾虛泄瀉方面的作用提供了思路。膜筏是GO 富集到的主要細胞組分之一，研究表明，在結腸炎和細菌相關性腹瀉中，膜筏對于細菌的粘附和信號傳導起重要的作用[25]。

本研究通過網絡藥理學研究方法，對七味白術散的成分、藥物作用靶點和治療脾虛泄瀉的潛在靶點及作用機制進行了研究和總結，發現七味白術散治療脾虛泄瀉的潛在機制可能是STAT3、TNF、IL6、AKT1、EGFR、CXCL8、IL1B、TP53、STAT1、IL4、EGF、IL2 等核心靶點通過Pathways in cancer 等通路，發揮了細胞因子受體結合、脂質結合、蛋白激酶活性結合的作用。

4 不足與展望

本研究通過生物信息學方法初步探索了七味白術散的主要成分和治療作用，為下一步實驗論證七味白術散治療脾虛泄瀉提供了研究基礎和研究思路。一般認為中藥復方通過多靶點、多途徑參與疾病的治療，本文通過網絡藥理學也初步論證了這一說法，但仍有許多不足之處。

從研究可以看出，核心靶點對應的成分主要存在于人參、葛根、藿香、甘草4 味中藥中，而在茯苓、木香、白術中并未發現。這可能有以下幾種原因：（1）數據庫的數據并不完善。本研究中的數據均來源于在線數據庫，數據庫的完善與否對研究結果的完整性起著至關重要的作用。（2）未體現出方劑學君臣佐使思想。在七味白術散中，人參為君，白術為臣，茯苓、葛根、藿香、木香為佐，甘草為使。在成分和靶點篩選后，人參和甘草成分出現頻率最高，且每味藥的權重相同，并不能看出君藥人參和使藥甘草在權重上的區別。（3）網絡藥理學的篩選為中藥機制的挖掘提供了一個良好的思路，但仍需要實驗進一步驗證，這也是本研究的不足之處。